OA 患者滑膜IL-7R 的表達及臨床診斷價值研究

武豪杰，張明輝，朱書濤，王曉

（河南大學淮河醫院 骨科，河南 開封 475000）

0 引言

骨性關節炎（osteoarthritis OA）是骨科比較常見的疾病，是一種隨著年齡的增長發病率明顯增加的慢性進行性骨關節病，嚴重危害老年人的身體健康。根據世界衛生組織的統計顯示，大于65 歲以上的人群中有50%以上都有膝關節骨性關節炎的臨床表現[1]。目前膝關節骨性關節炎的主要治療方法是早期采用止痛、保護、延緩軟骨退化等非手術方法治療，晚期軟骨破壞嚴重需要進行關節清理及膝關節表面置換等手術治療[2-3]。在漫長的保守治療和手術治療中會產生昂貴的治療費用。目前對于膝關節骨性關節炎的基因治療正成為世界研究的熱點[4-5]。白介素-7 受體（IL-7R）屬于I 型細胞因襲受體家族成員，IL-7R 是淋巴細胞增殖和分化過程中的必需因子，它在細胞表面的缺失會導致B 和T 淋巴細胞生成障礙[6]。最近的研究發現在類風濕關節炎患者免疫細胞表面，IL-7R 表達明顯增加，阻斷IL-7R可以明顯減輕關節炎的嚴重程度[7-8]。目前關于IL-7R 與膝骨性關節炎的研究表明，阻斷IL-7R 能夠降低RANKL 的蛋白表達，抑制RANK/RANKL 信號途徑，降低破骨細胞的形成和成熟，對軟骨細胞也有一定影響[9-10]。本研究主要探討膝關節骨性關節炎（OA）患者滑膜中IL-7R 基因的表達情況，對其臨床診斷價值進行討論，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

OA 組：選取我院骨科進行膝關節人工置換術患者41 例，年齡40-79 歲，平均（66.4±9.2）歲；對照組：選取我院骨科半月板損傷和交叉韌帶損傷進行關節鏡手術資料的患者36 例，年齡26-60歲，平均（38.1±11.3）歲。分別切取兩組患者膝關節髕上囊的滑膜組織置于無菌管后直接放入液氮中，30min 后放入-80℃保存。膝關節骨性關節炎患者符合Kellgren-Lawrence 分級標準的Ⅲ級和Ⅳ級。

1.2 OA 診斷標準

膝痛、關節活動時出現骨響、年齡≥40 歲、晨僵時間≤30min、膝關節X 射線異常。患者經過手術后等到明確診斷。

1.3 排除標準

患者我其他血液系統、關節炎性、免疫系統以及全身系統性疾病。

1.4 實驗方法

（1）基因芯片：取3 例新鮮正常的滑膜組織和10 例新鮮OA 患者的滑膜組織進行基因芯片檢測。并用Real time RT-PCR 對基因芯片結果進行驗證（委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行）。

（2）HE 染色、免疫組化實驗：將滑膜組織置于4%的多聚甲醛溶液中，在4℃固定24h 后進行脫水和石蠟包埋。將所有的標本按4μm 規格切片后固定于載玻片。將固定好的樣本進行HE 染色實驗和免疫組化實驗。免疫組化法：用3%的過氧化氫對內源性過氧化物酶進行封閉，加熱抗原修復，10%正常羊血清孵育，加入一抗，置于4℃冰箱中過夜，用PBS 緩沖液振蕩清洗（各30 min）后分別滴加二、三抗，DAB 顯色，蘇木素復染，常規封片。

（3）RT-PCR：引物設計：IL-7R引物序列為：5`-CTGTTGGACATCTCGGCCTGT-3`，3`-TATCGCACCTTCTGTAAGTTCG-5`；GAPDH 引物序列為：5`-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3`、3`-GCGACTCATCGAGCACCTC-5`。用Trizol 法對滑膜組織中的總RNA 進行提取，用Applied Biosystems逆轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA，PCR 擴增IL-7R 基因片段后進行逆轉錄聚合酶鏈式反應。對77 例患者的髕上滑膜組織中的IL-7R 表達和膝關節骨關節炎中的IL-7R 基因的表達進行檢測。

1.5 統計學處理

采用SPSS 17.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用（）表示，采用t檢驗，將P＜0.05判定為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 基因芯片

基因芯片結果如圖1 所示，共對22882 個基因進行了檢測，其中上升表達基因450 個、下降表達基因809 個，IL-7R 基因在膝關節OA 滑膜組織中的表達比膝關節正常滑膜組織低。我們進行了Real Time PCR 分析以驗證基因芯片的結果，結果表明IL-7R 在膝關節OA 滑膜組織中的表達顯著低于正常的膝關節滑膜組織。

圖1 基因芯片篩查結果

2.2 RT-PCR 分析

（1）組織總RNA 電泳結果：電泳結果顯示RTPCR 具有良好的特異性，見圖2。

圖2 組織總RNA 電泳結果

（2）IL-7RmRNA 統計學分析：對膝關節OA 滑膜組織和正常滑膜組織中的IL-7RmRNA 相對表達量分析顯示，IL-7RmRNA 在膝關節OA 滑膜組織中的表達量（0.13±0.55）顯著低于正常的膝關節滑膜組織（0.93±0.12），P=0.001。

（3）RT-PCR 檢測結果：RT-PCR 結果證實IL-7R在膝關節OA 滑膜組織中的表達顯著低于膝關節正常滑膜組織，見圖3。

圖3 RT-PCR 檢測結果

2.3 HE 染色結果

正常組和OA 組滑膜組織的HE 染色情況如圖3 所示，對照組滑膜組織的HE 染色結果顯示成纖維細胞整齊排列，可見較薄的滑膜襯里且細胞層數較少（圖4-a）。OA 組的染色結果顯示滑膜組織有類乳頭樣增生，可見較厚的滑膜襯里且細胞層數增多，還見有因增生而變大的巨噬細胞及成纖維細胞，此外滑膜的絨毛也變厚且部分出現纖維化（圖4-b）。

圖4 HE 染色結果

2.4 IL-7R 的免疫組化研究

對膝關節正常滑膜組織和OA 滑膜組織免疫組化研究結果顯示IL-7R 主要在膝關節滑膜組織的細胞漿中表達，且OA 滑膜組織中IL-7R 的表達量顯著低于正常滑膜組織，見圖5。

圖5 免疫組化研究結果

3 討論

IL-7R 和膝關節OA 的關在國內報道較少，本研究以正常的膝關節滑膜組織和膝關節OA 滑膜組織作為研究對象，采用基因芯片對膝關節正常滑膜和OA滑膜進行了檢測。通過基因芯片的篩查，我們發現IL-7R 基因在膝關節OA 滑膜組織中的表達比膝關節正常滑膜組織低。我們進行了Real Time RT-PCR 分析以進一步對基因芯片結果進行驗證，結果證實了IL-7R 在膝關節OA 滑膜組織中的表達顯著低于正常的膝關節滑膜組織。相比于傳統PCR 定量分析方法，Real Time RT-PCR 能顯著提高定量的準確度。傳統的定量方法主要通過中點檢測，通過對PCR 產物瓊脂糖電泳條帶進行光密度的掃描，其主要缺點在于結果準確性受PCR 平臺期影響較大。而Real Time RT-PCR 能有效避免該問題，Real Time RT-PCR 能利用Ct 值和起始模板對數的線性關系進行定量，且具有很好重現性。

本研究通過使用HE 染色對膝關節正常滑膜組織和OA 滑膜組，結果顯示膝關節正常滑膜組織的HE染色結果顯示成纖維細胞整齊排列，可見較薄的滑膜襯里且細胞層數較少。OA 滑膜組織的染色結果顯示滑膜組織有類乳頭樣增生，可見較厚的滑膜襯里且細胞層數增多，還見有因增生而變大的巨噬細胞及成纖維細胞，此外滑膜的絨毛也變厚且部分出現纖維化。免疫組化研究結果表明IL-7R 在滑膜細胞的細胞漿中表達，在膝關節OA 滑膜細胞中的表達量相對于正常膝關節滑膜細胞有明顯下降。RT-PCR 進一步證實了該結果。以上實驗結果證明了IL-7R 在膝關節正常滑膜組織和OA 滑膜組織中均有表達，但是在OA 滑膜組織中表達量相對降低。

有研究通過用IL-7R 對膠原誘導性關節模型進行治療并取得了良好的治療效果[11-12]。還有報道顯示IL7 對Th1 和Th17 細胞有很強激活效應，但是IL7 對于Th2 細胞的激活作用則相對較弱。因此通過阻斷IL-7R 能降低Th1 和Th17 細胞的細胞活性從而降低炎性因子IL-17 和干擾素-β 的表達[13-14]。還有研究證實了通過阻斷IL-7R 能夠有效RANKL 蛋白表達從而抑制了RANK/RANKL 信號通路，進而抑制了破骨細胞的生長，對軟骨細胞也具有一定的影響[15]。

綜上所述，IL-7R 在膝關節正常滑膜組織和OA滑膜組織中均有表達，但是在OA 滑膜組織中表達量相對降低。關于IL-7R 在治療骨性關節炎的作用還有待進一步研究。

IL-7R 和膝關節OA 的關在國內報道較少，本研究以正常的膝關節滑膜組織和膝關節OA 滑膜組織作為研究對象，采用基因芯片對膝關節正常滑膜和OA滑膜進行了檢測。通過基因芯片的篩查，我們發現IL-7R 基因在膝關節OA 滑膜組織中的表達比膝關節正常滑膜組織低。我們進行了Real Time RT-PCR 分析以進一步對基因芯片結果進行驗證，結果證實了IL-7R 在膝關節OA 滑膜組織中的表達顯著低于正常的膝關節滑膜組織。相比于傳統PCR 定量分析方法，Real Time RT-PCR 能顯著提高定量的準確度。傳統的定量方法主要通過中點檢測，通過對PCR 產物瓊脂糖電泳條帶進行光密度的掃描，其主要缺點在于結果準確性受PCR 平臺期影響較大。而Real Time RT-PCR 能有效避免該問題，Real Time RT-PCR 能利用Ct 值和起始模板對數的線性關系進行定量，且具有很好重現性。

本研究通過使用HE 染色對膝關節正常滑膜組織和OA 滑膜組，結果顯示膝關節正常滑膜組織的HE染色結果顯示成纖維細胞整齊排列，可見較薄的滑膜襯里且細胞層數較少。OA 滑膜組織的染色結果顯示滑膜組織有類乳頭樣增生，可見較厚的滑膜襯里且細胞層數增多，還見有因增生而變大的巨噬細胞及成纖維細胞，此外滑膜的絨毛也變厚且部分出現纖維化。免疫組化研究結果表明IL-7R 在滑膜細胞的細胞漿中表達，在膝關節OA 滑膜細胞中的表達量相對于正常膝關節滑膜細胞有明顯下降。RT-PCR 進一步證實了該結果。以上實驗結果證明了IL-7R 在膝關節正常滑膜組織和OA 滑膜組織中均有表達，但是在OA 滑膜組織中表達量相對降低。

有研究通過用IL-7R 對膠原誘導性關節模型進行治療并取得了良好的治療效果[11-12]。還有報道顯示IL7 對Th1 和Th17 細胞有很強激活效應，但是IL7 對于Th2 細胞的激活作用則相對較弱。因此通過阻斷IL-7R 能降低Th1 和Th17 細胞的細胞活性從而降低炎性因子IL-17 和干擾素-β 的表達[13-14]。還有研究證實了通過阻斷IL-7R 能夠有效RANKL 蛋白表達從而抑制了RANK/RANKL 信號通路，進而抑制了破骨細胞的生長，對軟骨細胞也具有一定的影響[15]。

綜上所述，IL-7R 在膝關節正常滑膜組織和OA滑膜組織中均有表達，但是在OA 滑膜組織中表達量相對降低。關于IL-7R 在治療骨性關節炎的作用還有待進一步研究。