不同集約化豬場豬群內毒素水平及免疫相關因子的監測

李中央，田 甜，強煜云，王圣翔，趙寶玉＊，吳晨晨＊

(西北農林科技大學動物醫學院/臨床獸醫系，陜西 楊陵 712100)

動物疫情肆虐、豬場疫病頻發，不斷刺激著養豬人的神經，人們不禁產生疑問：為什么豬群的免疫力如此脆弱？為什么使用優質疫苗免疫應答后水平參差不齊？這一系列的疫情頻繁發生主要是因為多數豬群處于亞健康狀態（介于健康與發病之間的一種狀態），動物的免疫系統受到抑制。當受到外界病原的攻擊時，隨時有爆發疾病的風險。最近研究發現，引起豬群亞健康狀態的主要原因之一為內毒素蓄積。內毒素又稱脂多糖（LPS），是革蘭氏陰性菌細胞壁的組成成分，在細菌生長期、穩定期以及細菌死亡崩解時會被釋放出來。內毒素耐熱且穩定，其化學本質不是蛋白質，即便在100 ℃下加熱1 h 也不會被破壞，只有在160 ℃ 或更高的溫度下加熱2 ～4 h，或用強堿、強酸、強氧化劑加熱煮沸30 min 才能破壞它的生物活性[1-2]。規模化豬場的內毒素來源廣泛，其主要來源為：圈舍空氣中的內毒素、對豬只抗生素大量使用和飼料中的內毒素[2]。豬只通過呼吸道和消化道長期攝入大量內毒素，長此以往，內毒素蓄積于動物體內細菌最大的儲存庫—腸道。當蓄積的內毒素破壞腸道黏膜的免疫屏障進入血液后，就會使機體的免疫功能發生紊亂。基于此，本研究選取兩個規模化豬場，分別為生物安全較好的豬場（豬場-I）和生物安全較差的豬場（豬場-II），收集兩豬場各個生長階段的豬群血液，檢測血液中內毒素和炎性因子水平，分析內毒素與炎性因子對豬群的影響，旨在為解決豬群亞健康狀態所表現的免疫力低下，呈現的免疫抑制狀態提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 樣品的收集

我們選取了陜西省楊凌周邊的2 個大型規模化養豬場。其中一個規模化豬場（豬場-I）嚴格執行生物安全制度，該豬場對場內運豬、運糞車輛出入生產區、隔離舍、出豬臺都要徹底消毒；更衣室、工作服、生活區辦公室、食堂、宿舍、公共場所和周圍環境每月消毒一次；員工休假回場必須隔離一天兩夜后方可進入生活區；每周至少一次對豬舍和豬群進行常規消毒，豬舍、豬群帶豬消毒提倡細化噴霧消毒與熏蒸消毒；一個季度至少進行一次藥物滅鼠，定期滅蠅和滅蚊；每次出豬后，對出豬臺都要進行重點消毒。另一個豬場我們選擇沒有按照生物安全制度嚴格執行的規模化豬場（豬場-II）。2 個規模化豬場都常規接種豬瘟、豬偽狂犬病、豬藍耳病和豬口蹄疫疫苗。

隨機選取兩個規模化豬場各個生長階段（5～8頭）的新生仔豬、10日齡仔豬、3周齡仔豬、7周齡保育豬、11周齡育成豬、15周齡育成豬、19周齡育成豬、23周齡育成豬、27周齡后備種豬、30周齡后備種豬、0胎次母豬、1～2胎次母豬和3～4胎次母豬。收集每個生長階段豬只前腔靜脈血10 mL，肝素鈉抗凝，3 000 r/min 分離血漿10 min，-20 ℃保存待檢。

1.2 檢測方法

分離2 個規模化豬場各個生長階段豬只血漿，應用E L I S A方法檢測，具體操作步驟詳見試劑盒說明書。本試驗主要檢測因子包括：豬分泌性免疫球蛋白A（sIgA）﹝ELISA試劑盒（1190708PA45）〕、豬超敏C反應蛋白（h s-CR P）﹝E L I S A試劑盒（11 9 0 7 0 8 PA 4 6）〕、豬白介素1（IL-1）﹝ELISA試劑盒（11 9 0 7 0 8 PA 4 7）〕、豬白介素4 （IL-4）﹝ELISA試劑盒（1190708PA48）〕、豬白介素10（IL-10）﹝ELISA試劑盒（1190708PA49）〕、豬腫瘤壞死因子α（TNF-α）﹝ELISA試劑盒（1190708 PA50）〕，以上試劑盒均購于上海酶聯試劑有限公司。

1.3 ELISA 檢測步驟

1.3.1 標準液的稀釋

150 μL 的 原 倍 標 準 品 加 入150 μL 的標準品稀釋液作為5 號標準品（400 ng/L）；150 μL 的5 號標準品加入150 μL 的標準品稀釋液作為4 號標準品（200 ng/L）；150 μL的4 號標準品加入150 μL 的標準品稀釋液作為3 號標準品（100 ng/L）；150 μL 的3 號 標 準 品 加 入150 μL的標準品稀釋液作為2 號標準品（50 ng/L）；150 μL 的2 號標準品加入150 μL 的標準品稀釋液作為1 號標準品（25 ng/L）。

1.3.2 加樣

分別設空白孔（空白對照孔不加樣品和酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5 倍），加樣將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕搖動混勻。

1.3.3 溫育

用封板膜封板后置37 ℃溫育

30 min。

1.3.4 配液

將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用。

1.3.5 洗滌

小心揭掉封板膜，棄去液體、甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去。如此重復5 次，拍干。

1.3.6 加酶

每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外。

1.3.7 溫育

用封板膜封板后置37 ℃溫育

30 min。

1.3.8 洗滌

小心揭掉封板膜，棄去液體、甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去。如此重復5 次，拍干。

1.3.9 顯色

每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL 輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min。

1.3.10 終止

每孔加終止液50 μL，停止反應，（此時藍色立轉黃色）。

1.3.11 測定

以空白孔調零，在450 nm 波長下依序測量各孔的吸光度（OD值），測定在加終止液后15 min 內進行。

1.3.12 計算

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值帶入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

1.4 數據統計

采用平均值±標準差來表示試驗數據。使用SPSS 13.0 (SPSS，Chicago，IL，USA) 來 進 行 分 析，包含2 個相關樣本分析。結果中，概率(P)值低于0.05 可認為具有統計學意義，表示為 * P＜0.05，對豬場-I 與豬場-II 同一生長階段豬群進行對比。

2 結果

2.1 兩個規模化豬場各個生理階段豬群血液內毒素水平的變化規律

豬場-II 各個生理階段豬群血液中內毒素的含量均顯著高于豬場-I 的豬群（P＜0.05）。在豬場-II，隨著飼養時間的延長，豬只體內蓄積的內毒素量也呈現上升趨勢；在豬場-I，隨著飼養時間的延長，豬只體內蓄積的內毒素量一直趨于平穩狀態，變化幅度較小。同時發現兩個規模化豬場0 胎次母豬血液內毒素的水平達到最高，隨著胎次和泌乳數量的增多，母豬血液內毒素的含量逐漸下降，但豬場-II 新生仔豬血液內毒素的含量顯著高于豬場-I 的新生仔豬（P＜0.05）（圖1）。說明嚴格執行生物安全體系可以凈化豬只體內的內毒素含量，并不隨著飼養時間的延長而使其體內內毒素的含量增加，同時發現母豬體內的內毒素可以穿透胎盤屏障和乳汁傳遞給新生仔豬。

2.2 兩個規模化豬場各個生理階段豬群血液sIgA 水平的變化規律

圖2 所示，豬場-I 各個生長階段豬群血液sIgA 水平均高于豬場-II。其中豬場-I 中的3 周齡仔豬、7 周齡仔豬、11 周育肥豬、15 周育肥豬和19 周育肥豬血液sIgA 的含量顯著高于豬場-II 中的同期豬群（P＜0.05）；兩個規模化豬場育肥豬23 周齡后血液sIgA 的含量呈下降趨勢。同時發現兩個規模化豬場0胎次母豬血液sIgA 的含量隨著胎次和泌乳數量的增多逐漸下降。豬場-I 育成母豬體內抗體水平較高，隨著日齡的增加豬只體內抗體水平逐漸下降，但是豬場-I 各個生理階段豬群的免疫抗體水平優于豬場-II的豬群。

2.3 兩個規模化豬場各個生理階段豬群血液超敏C 蛋白水平的變化規律

圖1 兩個規模化豬場各個生理階段豬群血液內毒素水平的變化規律

圖2 兩個規模化豬場各個生理階段豬群血液sIgA 水平的變化規律

圖3 所示，豬場-II 各個生理階段豬群血液超敏C 蛋白水平均高于豬場-I，其中豬場-II 中的新生仔豬、10 日齡仔豬、11 周齡育肥豬、15 周齡育肥豬、19 周齡育肥豬、23周齡育肥豬、27 周齡育肥豬、30 周齡育肥豬、0 胎次母豬、1 ～2 胎次母豬和3 ～4 胎次母豬血液超敏C 蛋白的含量顯著高于豬場-I 豬群（P＜0.05）。豬場-I 中23 周齡育肥豬血液超敏C 蛋白含量達到最高，之后開始下降，而豬場-II 中各個生長階段的豬群血液超敏C 蛋白的含量一直處于較高狀態。兩個豬場的母豬隨著胎次和泌乳數量的增加，其血液超敏C 蛋白水平亦皆呈下降趨勢，而新生仔豬體內超敏C 蛋白水平較高。說明豬場-II 各個生長階段豬群由于體內蓄積內毒素，引起豬只體內超敏C 蛋白的水平增多。

2.4 兩個規模化豬場各個生理階段豬群血液炎性因子水平的變化規律

圖4 所示，IL-1 濃度：豬場-I中7 周齡仔豬、11 周齡育肥豬、19周齡育肥豬血液IL-1 濃度顯著高于豬場-II 豬群（P＜0.05）；豬場-II 中0 胎次母豬、1 ～2 胎次母豬和3 ～4 胎次母豬血液IL-1 濃度顯著高于豬場-I（P＜0.05）；其他各個生理階段，兩個豬場的豬只血液IL-1 濃度無顯著性差異（P＞0.05）。

IL-4 濃度：豬場-I 中新生仔豬、3 周齡仔豬、7 周齡仔豬、11周育肥豬、15 周齡育肥豬、23 周齡育肥豬血液IL-4 濃度顯著高于豬場-II 豬群（P＜0.05）；豬場-I 中30周齡后備豬和3 ～4 胎次母豬血液IL-4 濃度顯著低于豬場-II 的豬群（P＜0.05）；2 個豬場其他各個生理階段豬群血液IL-4 濃度無顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 兩個規模化豬場各個生理階段豬群血液超敏C 蛋白水平的變化規律

TNF-ɑ 濃 度：豬 場-I 中10 日齡仔豬、7 周齡仔豬、11 周齡育肥豬、19 周齡育肥豬、23 周齡育肥豬、27 周齡后備豬和30 周齡后備豬血液TNF-ɑ 含量顯著高于豬場-II 豬群（P＜0.05）；2 個規模化豬場其他各個生理階段豬群血液TNF-ɑ 含量之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。

IL-10 濃度：豬場-I 中新生仔豬、10 日齡仔豬和3 周齡仔豬血液IL-10 濃度顯著高于豬場-II 豬群（P＜0.05）；2 個規模化豬場其他各個生理階段豬群血液IL-10 濃度之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。說明豬場-II 豬群長期大量的內毒素蓄積可能對豬只血液中炎性因子水平具有顯著的抑制作用。

3 討論

豬只體內內毒素的凈化與其生存環境存在密切的聯系。豬場圈舍大量使用消毒劑致空氣中細菌被殺死而釋放出內毒素，同時豬場濫用抗生素導致內毒素在豬腸道內大量蓄積，故豬只飼養時間越長，腸道蓄積內毒素的含量越多。內毒素化學結構穩定，常作為豬免疫神經內分泌相互作用的模型[6-8]，它不會直接危害細胞或器官，但可激活免疫系統，通過單核細胞和巨噬細胞起作用。細菌內毒素還可以進入機體的血液循環系統，對血液產生毒性作用，導致內毒素血癥。基于此，本試驗選取嚴格執行生物安全的豬場和執行力較差的豬場進行試驗，實時跟蹤各個生長階段豬群血液內毒素的含量變化趨勢，結果發現生物安全性能好的豬場豬群體內內毒素的含量明顯低于生物安全性能差的豬場。隨著產仔量和泌乳量的增加，多胎次母豬血液內毒素含量逐漸減少。豬場-II 新生仔豬體內內毒素的含量均顯著高于豬場-I的新生仔豬。體內大量內毒素蓄積的母豬產下的仔豬膚色較正常的淡紅色深一些，且腹股溝淋巴結發暗，排清水或灰黃色奶油狀稀便，持續兩三天后陸續出現嚴重的脫水消瘦現象，斷奶前死亡率接近100%。據此，我們推測生物安全性執行力較差的豬場，母豬體內蓄積的內毒素較高，妊娠的母豬可以通過哺乳和產仔把內毒素傳遞給新生仔豬，造成新生仔豬體內含有大量的內毒素，仔豬出現腹瀉和死亡的發病率顯著上升。

內毒素主要積聚在豬的腸道內，通過淋巴和血液循環進入外周血，sIgA 在腸道黏膜免疫中起到關鍵作用。sIgA 作為腸黏膜上的主要免疫球蛋白，是腸道黏膜上的第一道防線，對各種外界入侵的病原體都有抵抗作用[9-11]。血液中部分活化的B 細胞可通過黏膜的淋巴管進入血液循環，再經過增殖分化，生成能夠分泌IgA 的漿細胞。該漿細胞首先在胞漿內合成α 鏈和J 鏈，二者分泌到胞外瞬間聯結成帶J 鏈的IgA， 然后與上皮細胞表面的SC結合成sIgA，分泌到外分泌液中成為黏膜免疫的主要抗體。 本次研究中，豬場-II 豬群體內內毒素水平較高，但是其豬群血漿中sIgA 水平一直低于豬場-I，可見高內毒素暴露與豬血液內sIgA 水平呈負相關，血液sIgA 水平較低反映長期內毒素蓄積導致抗體免疫應答性能降低。Iqbal 等人表明，長期暴露于內毒素下可能會加快黏膜上皮細胞將血液中的IgA 分子轉化為sIgA，并促進sIgA 從血轉運到黏膜外側[12]。

圖4 兩個規模化豬場各個生理階段豬群血液炎性因子水平的變化規律

內毒素蓄積可引起發熱和炎癥反應， 因此內毒素被廣泛應用于研究豬和其他物種促炎細胞因子和急性期反應蛋白復雜機制的模型[13-14]。當內毒素進入血液可釋放很多促炎性介導物，如細胞因子等。本試驗首先分析了超敏C 蛋白，它是一種系統性炎癥急性期的非特異性標記物，檢測結果表明內毒素含量低的豬場-I 各個生長階段豬群血液超敏感C 蛋白含量低；內毒素含量高的豬場-II 豬群血液超敏感C 蛋白含量隨著飼養時間的延長持續升高。該結果提示，高水平內毒素可能會伴隨著急性炎癥的發生。因此，我們進一步分析了兩個規模化豬場各個生理階段豬群血液內炎性因子的水平，結果發現各炎癥因子并不會隨著內毒素水平的升高而呈現出一致的規律。豬場-I 各個生理階段豬群血液中TNF-a 水平均高于豬場-2，且相同豬場不同周齡之間差異較大。有報道在豬體內注射低劑量內毒素后，促炎細胞因子TNF-ɑ 的血漿濃度升高[15]；同時多項研究中報道對試驗動物反復暴露內毒素可能引起其內毒素耐受，導致TNF-ɑ水平降低。本試驗中豬場-II 由于豬體內長期暴露內毒素，使其TNF-ɑ水平降低。炎性因子IL-1 可促進單核巨噬細胞間的抗原呈遞，誘導炎癥介質的釋放，具有較強的制熱作用。豬場-II 豬體內IL-1 水平在豬只生長后期增高趨勢明顯，顯著高于豬場-I，這可能與豬體代謝水平有關，還需要進一步研究。Th2細胞主要是通過分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10 及IL-13 等 細 胞因子促進B 細胞的增殖、分化和抗體的生成，抑制Th1 細胞是IL-4 最重要的生物功能，這是Th1 細胞和Th2 細胞交叉調節的基礎。Th2 細胞的主要作用是增強B 細胞的體液免疫應答。而豬場-I 各個生理階段豬群IL-4 水平多高于豬場-II，兩豬場各生理階段豬群血液中IL-10 水平之間無顯著性差異。由此可證明豬場-II 豬只體內內毒素大量蓄積傾向于Th1 介導的免疫，而豬場-I 豬只體內內毒素含量較少傾向于Th2介導的免疫。這與另一項研究中提出的內毒素暴露可促進肉雞和肉牛體內Th2 介導的免疫應答一致[16]。這種結果可以解釋為，當內毒素濃度特別高和/或動物長期暴露于內毒素時，密集飼養動物的輔助T 細胞介導的免疫可能從Th2 向Th1 傾斜。因此，雖然在特異性皮炎的急性期Th2 反應占主導地位，但慢性期的炎癥與Th1 介導免疫應答上調有密切關系[17]。豬場-II 各個生理階段豬群炎性因子水平的降低我們推測是由于大量的內毒素蓄積導致免疫細胞出現壞死，導致分泌炎性因子的水平降低，此方面的機制還有待進一步研究。

4 結論

綜上所述，嚴格執行生物安全的豬場可以凈化豬只體內的內毒素含量。生物安全性執行較差的豬場隨著飼養時間的延長，豬群體內內毒素蓄積量越多，導致血液sIgA 含量會降低，炎性因子水平發生顯著的變化，免疫應答性能降低，引起免疫功能抑制，豬群處于亞健康狀態，最后使其生產性能和防御功能降低。