乙酰甲胺磷酸堿解離常數的測定

方倩囡，宋德安，孔凡玉

（中國農業科學院煙草研究所，山東青島 266101）

1972年，美國雪佛龍公司研究開發了一種新型有機磷農藥——乙酰甲胺磷（acephate），此后，乙酰甲胺磷在世界范圍內進行大規模的工業化量產，現已成為世界上銷售量最大的十種有機磷農藥之一[1]。作為高毒農藥甲胺磷的替代品，乙酰甲胺磷是一種高效、低毒、內吸性強的廣譜型殺蟲劑，能明顯抑制蚜科（煙草蚜蟲、小麥芽蟲）、鱗翅目（番茄斜紋夜蛾、棉花棉鈴蟲、茶樹茶尺蠖、玉米螟）、膜翅目（杜鵑三節葉蜂、黃連木種子小蜂）等害蟲對農作物的危害[2-3]。乙酰甲胺磷純品的大鼠急性經口半數致死量為823 mg/kg，工業品的大鼠急性經口半數致死量為945 mg/kg，其毒性僅為甲胺磷的1/50[4]。

酸堿解離常數（pKa）又稱解離平衡常數，定義為在一定溫度下弱電解質達到電離平衡狀態時，已解離的離子濃度的乘積與未解離分子濃度的比值。酸堿解離常數是與農藥溶解度和pH值密切相關的理化常數，也是探究農藥酸堿性等理化性質的重要信息[5-6]，在評價其對環境和人體健康的影響方面具有十分重要的意義。測定化學物質解離常數的方法目前主要有以下幾種：①紫外分光光度法；②電泳法；③熒光法；④電導率法；⑤電位滴定法。紫外分光光度法操作簡單、方便快捷，精密度高且重現性好，后期數據處理方便，特別適用于弱酸（堿）性物質解離常數的測定。

本實驗根據紫外分光光度法測定解離常數（pKa）的原理，首次采用紫外分光光度法及A-pH曲線法結合Sigmoidal數理模型擬合分段測定了乙酰甲胺磷的pKa1和pKa2值，并從分子基團的角度解釋其水解特性，對指導乙酰甲胺磷的合理使用，評價其環境安全性以及減少對環境的負面效應具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗原理

水溶性農藥在水溶液體系中可以發生電離，以弱酸類農藥HZ為例，將HZ溶解到水中，形成HZ穩定水溶液，HZ在水中達到電離平衡狀態HZ=H＋＋Z-，因此HZ在水溶液中解離常數，此等式兩邊同時取負對數，得到酸堿解離常數計算公式。

式中：HZ為共軛酸，Z-為共軛堿。

紫外分光光度法測定農藥的pKa具有一定條件要求：首先HZ和Z-均有紫外吸收，用紫外分光光度計可以測得具體數值；另外在同一酸堿條件下HZ和Z-的紫外吸收光譜呈現出明顯的差異性。實際測定時，配置一系列濃度相等的農藥水溶液，通過酸堿溶液KOH和HCl調節以上溶液體系的pH值：①將一部分農藥溶液pH值調節到7左右，讓溶液中的農藥以HZ和Z-兩種形式存在；②用HCl將另一部分農藥溶液pH值調節至酸性條件，此時水溶液中的農藥主要以HZ的形式存在；③用KOH將另一部分農藥溶液pH值調節至堿性條件，此時水溶液中的農藥主要以Z-的形式存在。設農藥的濃度為C，溶液中HZ的濃度為CHZ，Z-的濃度為CZ-。Abase是堿性條件下的吸光度，Aacid是酸性條件下的吸光度，Aobs是中性條件下的吸光度。如果HZ與Z-的紫外吸收均符合吸收定律，那么：

根據式（2）即可計算出農藥的pKa值[7]。

1.2 實驗試劑與儀器

SPECORD200型紫外分光光度計，德國耶拿分析儀器股份公司；PHS-3C酸度計，上海雷磁儀器廠，使用前在pH值4.00、6.86和9.18處校準；乙酰甲胺磷（純度99%）；KOH、HCl和KCl均為分析純，北京國藥化學試劑有限公司；實驗用水為蒸餾水。

1.3 實驗方法

乙酰甲胺磷溶液的配制：稱取乙酰甲胺磷原藥0.018 3 g，置于100 mL容量瓶中，加入蒸餾水溶解并定容，即得到濃度為1 mmol/L的乙酰甲胺磷溶液。

緩沖溶液：0.1 mol/L HCl與0.1 mol/L NaOH溶液按不同的比例進行混合，制備成pH值為2.87～8.12的一系列溶液，加入乙酰甲胺磷溶液中，并加入2 mol/L KCl溶液0.25 mL控制離子強度。

分別將不同pH值的乙酰甲胺磷溶液置于1 cm吸收池中，以對應的pH值溶液做空白對照，在210～250 nm波長范圍內掃描，得到不同pH值的乙酰甲胺磷溶液的紫外吸收光譜。選擇合適波長處測定不同pH值的乙酰甲胺磷溶液的吸光度值，利用Origin 9.0軟件擬合曲線求出乙酰甲胺磷的解離常數[8]。

2 結果與分析

2.1 測定波長的選定

圖1為不同pH值條件下乙酰甲胺磷溶液的210～250 nm紫外吸收光譜圖，可以看出pH值為2.21～4.98的溶液的紫外吸收光譜基本重合，可以認為pH值在4.98以下，乙酰甲胺磷基本上以分子形式存在；pH值為9.61～12.13的緩沖溶液的紫外吸收光譜基本重合，可以認為pH值在9.61以上，乙酰甲胺磷基本上以離子形式存在；pH值為4.98～9.61，乙酰甲胺磷一部分以分子狀態存在，一部分以離子狀態存在。

圖1 乙酰甲胺磷在不同pH值的緩沖溶液中的紫外吸收光譜

乙酰甲胺磷在波長210 nm、217 nm和230 nm處隨pH值的變化，曲線呈現規律性變化，因此可以選擇這3個波長作為測定波長。

將210 nm、217 nm和230 nm波長處不同pH值下乙酰甲胺磷溶液的吸光度繪制成圖2，于210 nm和217 nm處可以觀測曲線有3個拐點，所以乙酰甲胺磷有2個pKa值。

圖2 3個波長下不同pH值的乙酰甲胺磷溶液的吸光度

2.2 乙酰甲胺磷一級解離常數（pKa1）的測定

由圖2可知，乙酰甲胺磷有2個pKa值。根據3個波長下不同pH值的乙酰甲胺磷溶液的吸光度，利用Origin 9.0軟件以pH值為橫坐標，以不同pH值對應的吸光度值為縱坐標，以Sigmoidal數理模型擬合曲線方程，求得pKa。

對于pKa1，擬合曲線方程：

其中，Abase、Aacid、x都在圖2中可知，將數據輸入擬合曲線方程中，利用Origin 9.0分析可得乙酰甲胺磷的解離常數pKa1。根據圖2，選擇3個波長處的pH值為2～12的吸光度值進行Sigmoidal數理模型擬合，得到圖3、圖4和圖5。

圖3 波長210 nm處Sigmoidal數理模型擬合A-pH曲線

圖4 波長217 nm處Sigmoidal數理模型擬合A-pH曲線

圖5 波長230 nm處Sigmoidal數理模型擬合A-pH曲線

由圖3、圖4和圖5模擬分析結果可得，當波長為210 nm時，pKa1值為7.483 65，相關系數為0.990 68；當波長為217 nm時，pKa1值為7.422 60，相關系數為0.992 07；波長為230 nm時，pKa1值為7.497 55，相關系數為0.973 93；所得的pKa1值比較可靠。求得乙酰甲胺磷解離常數的平均值pKa1為7.467 93。

2.3 乙酰甲胺磷二級解離常數（pKa2）的測定

對于pKa2，由于pH值大于12.5的數值難以在實驗條件下測得，所以曲線采用賦值測試的方法進行擬合。選取210 nm處pH值大于9.4的數據進行賦值擬合，設初始值Aacid=1，Abase=3，曲線擬合結果見圖6。

圖6 波長210nm處Sigmoidal數理模型擬合A-pH曲線

由圖6模擬分析結果可得，在pH值為9.5～12.5時，波長為210 nm時，pKa2值為12.778 3，相關系數為0.998 71。

2.4 理論分析乙酰甲胺磷解離常數的合理性

乙酰甲胺磷的水解位點見圖7。乙酰甲胺磷的分子結構中存在3個可能的水解位點，包括磷酸基、仲氨基、羰基。其中對于仲氨基來說，其具有較多的取代基，在誘導效應與位阻效應的雙重作用下，較難發生水解。因此，仲氨基的水解常數一般在10以上。這與本實驗中pKa2值為12.778 3的結果基本吻合，故可以推測乙酰甲胺磷的第2個水解常數應發生在仲氨基。比較而言，磷酸基較易發生水解反應，且一般在中性pH值附近，因此可將乙酰甲胺磷的第1個水解常數（pKa1值為7.467 93）歸因于磷酸基的水解過程[9]。而對于羰基，其孤對電子難以與質子發生結合，因此可以認為在本實驗的pH值范圍內不發生水解反應[10-11]。

圖7 乙酰甲胺磷的水解位點

3 結論

本研究采用紫外分光光度法及A-pH曲線法結合Sigmoidal數理模型擬合分段測定了乙酰甲胺磷的解離常數，測得乙酰甲胺磷的一級（pKa1）、二級（pKa2）解離常數分別為7.467 93、12.778 3。

本實驗選取了3個測定波長210 nm、217 nm和230 nm，分別計算在這3個波長下乙酰甲胺磷的解離常數。這3個波長下經繪圖軟件擬合的曲線相關系數均大于0.95，測定結果可靠。

乙酰甲胺磷的分子結構中存在3個可能的水解位點：磷酸基、仲氨基和羰基。仲氨基的水解常數在10以上，這與本實驗中的pKa2值為12.778 3的結果基本吻合，磷酸基較易在中性pH值附近發生水解反應，因此可與乙酰甲胺磷的一級解離常數（pKa1值為7.467 93）相對應。