魚腥草中總黃酮的提取工藝優(yōu)化研究

劉浩 唐紅楓

摘要：以魚腥草（Houttuynia cordata Thunb.）總黃酮提取率為考察指標，以蘆丁為對照品，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計對乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度及提取時間4因素進行優(yōu)選。結(jié)果表明，將魚腥草粉末與70%乙醇溶液進行1∶25混合，置于70 ℃恒溫水浴箱中浸提90 min，此條件下魚腥草總黃酮提取率為3.640%，為優(yōu)化魚腥草中總黃酮的提取工藝提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：魚腥草（Houttuynia cordata Thunb.）;總黃酮;工藝優(yōu)化;正交設(shè)計

中圖分類號：R284.2? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）21-0155-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.21.033

Abstract： The extraction medium was selected，the extraction rate of total flavonoids from Houttuynia cordata was taken as the index， and rutin was taken as the reference substance. On the basis of single factor test， four factors such as ethanol concentration， liquid-liquid ratio， extraction temperature and extraction time were optimized by orthogonal design. The results showed that the optimal solution for extracting total flavonoids from Houttuynia cordata by ethanol extraction method was as follows： Houttuynia cordata powder was mixed with 75% ethanol solution in a ratio of 1∶25 and placed in a constant temperature water bath at 70 ℃ for 90 min， the total flavonoid extraction rate of Houttuynia cordata was 3.640%. This experiment provides a reference for optimizing the extraction process of total flavonoids from Houttuynia cordata.

Key words： Houttuynia cordata Thunb.; total flavonoids; optimization of procedure; orthogonal design

魚腥草（Houttuynia cordata Thunb.）干燥的地上葉莖是一味被收錄于《中國藥典》的草藥。魚腥草主要分布在亞洲東部、東南部，因其喜濕怕旱，通常會在背陰山坡、河畔田埂等土壤潮濕處蔓延生長[1]。魚腥草味辛性寒，入肺經(jīng)。有清熱解毒、利尿消腫、健胃消食之效[2，3]，能治瘧疾、肺炎、濕疹等病癥，還能增強機體免疫力。魚腥草主要有蕺菜堿、蕓香甙、金絲桃甙、槲皮甙等黃酮類化合物[4-6]，它們是魚腥草水溶性成分中重要藥用組成部分，其藥理作用有降血糖、降血脂、抗氧化、清熱解毒等[7]。在抗氧化劑中，黃酮類化合物較常見[8]，如蘆丁、槲皮素等能夠增強心臟的收縮;杜鵑素能夠鎮(zhèn)咳祛痰;黃芩苷能夠解熱鎮(zhèn)痛;水飛薊素能夠保肝凝血等[9，10]。

魚腥草中黃酮類化合物具有廣泛的藥用保健價值[11]，但目前黃酮類化合物的提取效率并不高。本研究對影響提取效率的4因素（乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度、提取時間）設(shè)計正交試驗，得出乙醇提取魚腥草中總黃酮的最優(yōu)方案。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料? 鮮魚腥草，由武漢東湖學(xué)院中草藥研發(fā)試驗基地提供。

1.1.2? 儀器? 電鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司;中草藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司;數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水箱，常州國華電器有限公司;紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司;電子分析天平，上海臺衡儀器儀表有限公司;UV-1800型紫外分光光度計，日本島津公司。

1.1.3? 試劑? 蘆丁標準品，UV≥98%，購于上海金穗生物科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2? 方法

1.2.1? 材料的制備? 采摘新鮮魚腥草根莖，自來水洗去泥沙灰塵，將魚腥草莖切成1 cm小段，浸泡于蒸餾水中，漂洗3次，將水瀝干，用潔凈的紗布包裹放入40 ℃烘箱中干燥至恒重后在中草藥粉碎機中研磨2次，5 min/次，過40目篩，收集過篩后的魚腥草粉末，置于密封袋中于陰涼干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 蘆丁標準曲線的繪制及提取溶劑的選擇? 蘆丁標準曲線繪制和魚腥草樣品粗提液的制備按照文獻[12，13]方法進行。將5份1.000 g 魚腥草粉末分別加入到不同溶劑（石油醚、純水、丙酮、70%乙醇、乙酸乙酯）中，用保鮮膜封口，60 ℃恒溫水浴30 min。然后逐一抽濾并收集濾液，將濾液用70%乙醇溶液在室溫下定容至50 mL，放置15 min，測A510 nm，根據(jù)蘆丁標準曲線計算出魚腥草根中總黃酮的提取率Q，確定最佳提取溶劑，計算公式如下：

Q=[（c×V×n）/（m×103）]×100%

式中，c為回歸方程算得魚腥草莖中總黃酮的濃度，mg/mL;V為粗提液定容體積，mL;n為粗提液稀釋倍數(shù);m為魚腥草粉末質(zhì)量，g。

1.2.3? 單因素試驗

1）浸提介質(zhì)濃度。將5份1.000 g魚腥草粉末分別加入到30.00 mL不同體積分數(shù)的已確定的最佳提取溶劑（40%、50%、60%、70%、80%）中，用保鮮膜封口，然后按“1.2.2”中粗提液的制備及提取率計算處理。

2）料液比。根據(jù)最佳提取溶劑及濃度，將5份1.000 g魚腥草粉末分別加入到不同料液比（g/mL，1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）燒杯中，用保鮮膜封口，然后按“1.2.2”中粗提液的制備及提取率計算處理。

3）提取溫度。根據(jù)最佳提取溶劑、浸提介質(zhì)濃度和最佳料液比結(jié)果，將5份1.000 g魚腥草粉末分別加入到相應(yīng)溶液中，用保鮮膜封口，分別放在40、50、60、70、80 ℃的恒溫水浴箱中浸提30 min，然后按“1.2.2”中粗提液的制備及提取率計算處理。

4）提取時間。根據(jù)最佳提取溶劑、浸提介質(zhì)濃度和最佳料液比結(jié)果，將5份1.000 g魚腥草粉末分別加入到對應(yīng)溶液中，用保鮮膜封口，在最佳提取溫度下恒溫水浴30、60、90、120、150 min，并收集濾液，然后按“1.2.2”中粗提液的制備及提取率計算處理。

1.2.4? 正交試驗? 在綜合單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9（34）設(shè)計了四因素三水平正交試驗，因素與水平見表1。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 最大吸收波長的確定

經(jīng)400～600 nm掃描檢測得到蘆丁標準品溶液的吸收波長曲線，截取450～550 nm曲線如圖1。由圖1可知，魚腥草中總黃酮的最大吸收波長為510 nm，故將510 nm作為測定魚腥草中總黃酮含量的吸收波長。

2.2? 蘆丁溶液濃度標準曲線

以蘆丁質(zhì)量濃度c（mg/mL）為橫坐標，以A510 nm為縱坐標，繪制蘆丁濃度標準曲線如圖2。

2.3? 提取溶劑的選擇

以石油醚、純水、丙酮、70%乙醇、乙酸乙酯為浸提介質(zhì)[14]，樣品溶液的總黃酮提取率如圖3。由圖3可知，提取率最高的浸提介質(zhì)是70%乙醇，其總黃酮提取率為3.088%，故將70%乙醇作為最佳浸提介質(zhì)。

2.4? 單因素試驗結(jié)果

2.4.1? 乙醇體積分數(shù)? 選用不同體積分數(shù)的乙醇溶液為浸提介質(zhì)提取總黃酮試驗結(jié)果見圖4。由圖4可知，魚腥草中總黃酮的提取率隨乙醇體積分數(shù)的升高而增加，當(dāng)乙醇體積分數(shù)達70%時，提取率達到最高，但繼續(xù)加大體積分數(shù)后，提取率反而下降，可能原因是乙醇體積分數(shù)過高導(dǎo)致一些植物組織中醇溶性雜質(zhì)、親脂性成分及色素溶解增多，與黃酮類化合物形成競爭，從而使總黃酮提取率下降。由于植物中總黃酮一部分易溶于水，大部分易溶于有機溶劑，故70%乙醇溶液符合預(yù)期推測。

2.4.2? 料液比? 由圖5可知，隨著提取溶劑的增大，魚腥草中總黃酮的提取率增加。當(dāng)溶劑較少時，樣品未能與乙醇溶液充分接觸，使得有效成分浸出不完全，但溶劑的增加使后續(xù)濃縮時間增長，且當(dāng)樣品溶解達到飽和狀態(tài)后會引起不必要的溶劑消耗。當(dāng)料液比1∶30時，樣液中總黃酮的提取率最高，為3.092%。但是料液比為1∶25時，總黃酮提取率為3.079%。考慮到工業(yè)生產(chǎn)成本，料液比1∶30相對于1∶25增效十分有限，故將1∶25作為最佳料液比。

2.4.3? 提取溫度? 將1∶25料液比體系的70%乙醇溶液和魚腥草粉末置于5個不同溫度下水浴浸提30 min，總黃酮提取率見圖6。由圖6可知，提取溫度低于70 ℃，魚腥草中總黃酮提取率隨溫度升高而顯著增加，因為分子運動速率加大。但溫度高于70 ℃后，提取率升高緩慢，因為黃酮類化合物具有多個苯環(huán)和酚羥基，在高溫條件下其化學(xué)性質(zhì)活潑、易發(fā)生氧化反應(yīng)與縮合反應(yīng)。當(dāng)溫度為80 ℃時，魚腥草中總黃酮的提取率最高，為3.326%;溫度為70 ℃時，總黃酮提取率為3.273%。溫度過高不僅造成乙醇揮發(fā)速度加快，而且導(dǎo)致樣品中活性成分的濕熱降解或異構(gòu)化，使得黃酮有效成分減少。從節(jié)能減排以及高溫對提取物穩(wěn)定性的影響方面考慮，將70 ℃作為最佳提取溫度。

2.4.4? 提取時間? 以70%乙醇為浸提介質(zhì)、1∶25料液比、70 ℃水浴浸提，探究最佳的水浴時間對總黃酮提取率的影響（圖7）。由圖7可知，魚腥草中總黃酮提取率隨提取時間增長而增加，但速率逐漸減緩，一方面是浸提步驟接近完成，另一方面因長時間受熱使得部分游離黃酮被氧化分解，且提取溶劑揮發(fā)較多。當(dāng)浸提水浴時間150 min時，魚腥草中總黃酮提取率最高，為3.740%。但是90～150 min總黃酮提取率只提高了0.101個百分點。結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)成本考慮，以及長時間高溫環(huán)境對物質(zhì)穩(wěn)定性的影響，將90 min作為最佳提取時間。

2.5? 正交試驗結(jié)果

由乙醇浸提法提取魚腥草總黃酮的正交試驗結(jié)果（表2）可知，以上4種因素的極差依次為D>B>A>C，因此影響魚腥草中總黃酮提取率的因素排序為浸提時間>料液比>乙醇體積分數(shù)>浸提溫度，所得最佳組合條件為A2B2C2D2，即乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶25，水浴溫度70 ℃，浸提時間90 min。

2.6? 驗證試驗

按最優(yōu)條件進行3組平行試驗，結(jié)果見表3。3次魚腥草總黃酮提取率依次為3.652%、3.626%、3.643%，平均值3.640%，表明最優(yōu)組合優(yōu)化方案可行。