脊髓損傷急性期IL-6的表達及其動態變化

張曄 李媛 史文心 周酈楠

【摘要】 目的 探討脊髓損傷（SCI）急性期不同時間點白細胞介素-6（IL-6）表達的動態變化及其意義， 為SCI的治療提供理論依據。方法 120只Wistar大鼠， 隨機分成正常對照組（8只）、Sham組（56只）、SCI組（56只）， Sham組和SCI組分別于術后0、2、4、8、12、24、48 h取材。正常對照組大鼠未進行手術操作， Sham組只咬除棘突并且不損傷脊髓， SCI組采用改良Allen s撞擊法制備大鼠急性SCI模型， 比較三組大鼠不同時間點的行為學評分法（BBB）評分及脊髓組織中IL-6的表達。結果 SCI組大鼠術后BBB評分均低于正常對照組及Sham組， 差異具有統計學意義（P<0.01）;且術后48 h BBB評分高于術后4 h， 差異具有統計學意義（P<0.05）。SCI組大鼠術后各時間點大鼠脊髓組織中IL-6的表達高于正常對照組及Sham組， 差異具有統計學意義（P<0.01）， 且于術后12 h達高峰， 隨后IL-6的表達下降。Sham組大鼠不同時間點的脊髓組織中IL-6的表達有所增高， 但與正常對照組比較， 差異均無統計學意義（P>0.05）。結論 IL-6在 SCI急性期明顯升高， IL-6參與急性 SCI的繼發性損害。

【關鍵詞】 脊髓損傷;急性期;白細胞介素-6;動態變化

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.32.107

SCI是臨床常見的高致殘率中樞神經系統損傷性疾病， 是脊柱損傷最嚴重的并發癥。它可導致損傷部位的出血、水腫， 神經細胞凋亡和壞死， 損傷平面以下的運動功能喪失， 以及感覺反射的減弱或消失 [1]。SCI患者給個人、家庭和社會帶來巨大的痛苦與負擔[2]。一般外力作用下的SCI不能造成脊髓解剖上的完全橫斷， 而脊髓功能喪失主要是由于急性損傷后脊髓缺血缺氧引起的繼發性損害[3]。SCI后多種炎性因子的表達增加， 炎性因子的表達可導致相應的炎性細胞進入受損的脊髓產生炎性反應， 導致受損區域內部環境紊亂， 并且不可能重建SCI中受損的軸突， 從而加重SCI。減少繼發性損傷是避免SCI進一步惡化的關鍵。本實驗通過測定SCI中不同時間點IL-6的表達， 尋找治療的關鍵時間點， 為SCI的治療提供理論依據。現報告如下。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 SPF級Wistar雄性大鼠120只（由遼寧長生生物技術有限公司提供）， 體重（200±20）g， 分籠飼養， 自然光照， 自由飲食、飲水， 適應性飼養1周。

1. 2 試劑儀器 大鼠IL-6酶聯免疫檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）;DY89-Ⅱ電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）;DR-200Bs酶標分析儀（無錫華衛德朗儀器有限公司）。

1. 3 實驗方法

1. 3. 1 實驗分組 將120只Wistar大鼠隨機分為正常對照組（8只）、Sham組（56只）、SCI組（56只）。Sham組和SCI組分別于術后0、2、4、8、12、24、48 h取材， 每個時間點取8只大鼠。

1. 3. 2 大鼠SCI模型制備及術后處理 術前將大鼠禁食水12 h， 腹腔麻醉（1%戊巴比妥鈉， 40 ml/kg體重）。麻醉起效后， 將大鼠俯臥位固定在手術臺上， 術區備皮， 常規消毒鋪巾。以T10為中心做背部正中切口， 分離皮下組織及骨骼肌， 暴露T9～11， 剔除該節段棘突及椎板（操作中保持硬脊膜完整）， 顯露相應脊髓節段作為造模區。采用改良的Allens撞擊法[4]， 使8 g（直徑2 mm）金屬圓柱體從高度50 mm處通過導管（內徑2.5 mm）自由落下， 對大鼠脊髓進行定量打擊（撞擊力為下落高度50 mm×圓柱體重量8 g）， 建立大鼠急性SCI模型。造模成功的標志：大鼠表現出尾部短暫搖擺， 雙后肢和身體回縮式撲動， 繼而雙后肢呈遲緩性癱瘓。逐層縫合。術后常規護理， 人工輔助白天每4 h排尿、排便1次， 直至相應時間點處死。正常對照組未進行手術操作;Sham組只咬除棘突并且不損傷脊髓。

1. 3. 3 實驗動物取材 Sham組和SCI組分別于術后0、2、4 、8、12、24、48 h處死各組大鼠， 正常對照組于術后48 h處死。沿原手術切口， 取出損傷段和上下各5 mm的脊髓組織， 稱重。按1︰9比例加入生理鹽水， 用電動玻璃勻漿機研磨脊髓組織， 并于離心機上以3000 r/min離心10 min， 取上清液， -20℃保存。

1. 3. 4 觀察指標及判定標準 比較三組大鼠不同時間點的BBB評分及脊髓組織中IL-6的表達。采用BBB對各組大鼠的運動功能進行評分， 分值為0～22分， 0分為完全癱瘓， 22分為完全正常， 評分越高表示大鼠后肢運動功能越好[5]。采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測脊髓組織中IL-6的表達。

1. 4 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

大鼠在麻醉后進行SCI手術操作， 術后約1～2 h清醒。清醒后大鼠行動遲緩、二便障礙、雙下肢癱瘓， 進食、進水情況較差。

實驗過程中死亡3只大鼠：SCI組和Sham組大鼠過度麻醉各死亡1只， SCI組大鼠術后因泌尿系感染死亡1只。Sham組大鼠因手術操作失誤至下肢輕度功能障礙剔除2只。其余大鼠均存活至取材時間點， 各組死亡及剔除大鼠于實驗中隨時補齊。

2. 1 三組大鼠不同時間點的BBB評分比較 正常對照組大鼠不同時間點的BBB評分均為滿分21分。Sham組大鼠不同時間點的BBB評分均為滿分21分。SCI組大鼠術前BBB評分為滿分;術后， SCI組4、8、12、24、48h的BBB評分分別為（0.1±0.316）、（0.2±0.422）、（0.6±0.699）、（1.2±0.632）、（1.9±0.876）分， 均低于正常對照組及Sham組， 差異具有統計學意義（P<0.01）;且術后48 hBBB評分高于術后4 h， 差異具有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2. 2 三組大鼠不同時間點脊髓組織中IL-6的表達比較 正常對照組大鼠不同時間點的脊髓組織中IL-6的表達較少， Sham組大鼠不同時間點的脊髓組織中IL-6的表達有所增高， 但與正常對照組比較， 差異均無統計學意義（P>0.05）。SCI組大鼠術后各時間點大鼠脊髓組織中IL-6的表達高于正常對照組及Sham組， 差異具有統計學意義（P<0.01）， 且于術后12 h達高峰， 隨后IL-6的表達下降。見表1， 圖2。

3 討論

在脊髓發生原發性損傷后， 隨之而來的繼發性損傷是導致神經通路損傷和功能障礙的主要原因[6]。炎性細胞因子及炎性反應在繼發性損傷的各種機制中起著重要作用， IL-6又是其中主要成員[7]。作為細胞間信號傳導的介質， 它廣泛參與調節細胞功能， 維持動物體的內環境穩定。正常情況下， 神經系統內IL-6水平表達比較低， 但一定濃度的IL-6是維持神經細胞正常生長和生存的基礎， 而且還會影響神經細胞的分化、生長和生存。

本驗結果顯示， SCI組大鼠術后BBB評分均低于正常對照組及Sham組， 差異具有統計學意義（P<0.01）;且術后48 h?BBB評分高于術后4 h， 差異具有統計學意義（P<0.05）。SCI組大鼠術后各時間點大鼠脊髓組織中IL-6的表達高于正常對照組及Sham組， 差異具有統計學意義（P<0.01）， 且于術后12 h達高峰， 隨后IL-6的表達下降。Sham組大鼠不同時間點的脊髓組織中IL-6的表達有所增高， 但與正常對照組比較， 差異均無統計學意義（P>0.05）。

IL-6是炎性細胞分化的重要調節因子[8]。IL-6對中樞神經系統的影響是雙向的， 不僅可以促進激活的巨噬細胞分化和浸潤， 還可以上調其他細胞因子的表達， 從而加強炎性反應。IL-6過度表達引起脊髓繼發性損傷的同時也促進神經干細胞向神經膠質細胞分化[9， 10]。研究促炎因子達到峰值的時間點、阻斷SCI期間的繼發性損傷是SCI早期治療的最主要目標。

綜上所述， IL-6在 SCI急性期明顯升高， IL-6參與急性 SCI的繼發性損害。

參考文獻

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[收稿日期：2019-03-19]