骨髓間充質干細胞對大鼠急性肺損傷的影響

石智勇　侯念果　李會　帥訓軍　楊洪光　孫常榮　路文卿　艾登斌

[摘要]目的 探討骨髓間充質干細胞（BMSCs）減緩大鼠急性肺損傷（ALI）的機制。方法 36只6～7周齡雄性SD大鼠適應性飼養1周后，隨機取12只作為對照組（Con組），其余大鼠均經尾靜脈注射脂多糖（LPS）制作大鼠急性肺損傷模型。若大鼠模型的氧合指數（PaO2/FiO2）<300 mmHg，肺組織病理學評分升高，濕重（W）/干重（D）值升高，提示造模成功。將模型大鼠隨機分為模型組（ALI組）和治療組（BMSCs組），每組12只。BMSCs組造模1 h后氣管內注射100 μl BMSCs懸浮液（細胞總數為5×106），Con組和ALI組氣管內注射100 μl 0.9%生理鹽水。24 h后腹主動脈置入導管抽取動脈血測定血氧分壓（PaO2）并計算PaO2/FiO2;取肺組織行病理學評分、測量W/D;酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測支氣管肺泡灌洗液（BALF）中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1α（IL-1α）、白細胞介素-10（IL-10）水平;采用血細胞計數儀測定中性粒細胞數（PMN）;蛋白免疫印跡法（Western-Blot）測定肺組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達，并計算Bcl-2/Bax。比較三組大鼠的PaO2/FiO2、W/D、肺組織病理學評分、TNF-α、IL-1α、IL-10、PMN、Caspase-3、Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax水平。結果 ALI組和BMSCs組的W/D、肺組織病理學評分、TNF-α、IL-1α、IL-10水平、PMN數目、Caspase-3蛋白、Bax蛋白的表達高于Con組，PaO2/FiO2、Bcl-2蛋白表達、Bcl-2/Bax低于Con組，差異均有統計學意義（P<0.05）;BMSCs組的W/D、肺組織病理學評分、TNF-α、IL-1α、PMN數目、Caspase-3蛋白及Bax蛋白表達低于ALI組，IL-10水平、PaO2/FiO2、Bcl-2蛋白及Bcl-2/Bax高于ALI組，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論 BMSCs可抑制大鼠ALI模型的肺組織細胞凋亡，其機制可能與上調了肺組織中的Bcl-2蛋白和下調了Bax蛋白和Caspase-3蛋白的表達有關。

[關鍵詞]骨髓間充質干細胞;急性肺損傷;脂多糖;凋亡

[中圖分類號] R563? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）10（b）-0011-05

[Abstract] Objective To explore the mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） in alleviating acute lung injury （ALI） in rats. Methods Thirty-six male SD rats aged 6-7 weeks were fed for one week. Twelve rats were randomly selected as control group （Con group）， the other rats were injected with lipopolysaccharide （LPS） via caudal vein to establish acute lung injury model. If the oxygenation index （PaO2/FiO2）<300 mmHg， the pathological score of lung tissue increased， and the wet weight （W）/dry weight （D） value increased， suggesting that the model was successful. The model rats were randomly divided into model group （ALI group） and treatment group （BMSCs group）， with 12 rats in each group. In BMSCs group， 100 ml BMSCs suspension was injected into the trachea after 1 hour of modeling （the total number of cells was 5×106）， 100 ml 0.9% saline was injected into the trachea of Con group and ALI group. After 24 hours， the abdominal aorta was inserted with a catheter to extract arterial blood and the partial pressure of oxygen （PaO2） was measured and PaO2/FiO2 was calculated. The lung tissues were taken for pathological scoring and W/D was measured. The levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1α （IL-1α） and interleukin-10 （IL-10） in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The number of neutrophils （PMN） was measured by blood cell counting instrument. The expression of Bcl-2 protein， Bax protein and Caspase-3 protein in lung tissue was determined by Western-Blot， and the expression of Bcl-2/Bax was calculated. The levels of PaO2/FiO2， W/D， lung histopathological score， TNF-α， IL-1α， IL-10， PMN， Caspase-3， Bcl-2， Bax and Bcl-2/Bax were compared among the three groups. Results The W/D， lung histopathological score， TNF-α， IL-1α， IL-10， PMN number， Caspase-3 protein and Bax protein expression in ALI group and BMSCs group were higher than those in Con group， while PaO2/FiO2， Bcl-2 protein expression and Bcl-2/Bax protein expression were lower than those in Con group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The W/D， lung histopathological score， TNF-α， IL-1α， PMN number， Caspase-3 protein and Bax protein expression in BMSCs group were lower than those in ALI group， IL-10 level， PaO2/FiO2， Bcl-2 protein and Bcl-2/Bax in BMSCs group were higher than those in ALI group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion BMSCs can inhibit apoptosis of lung tissue in rat ALI model， which may be related to up-regulation of Bcl-2 protein and down-regulation of Bax protein and Caspase-3 protein expression in lung tissue.

1.5統計學方法

采用統計學軟件SPSS 19.0分析數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗;計數資料以率表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1三組大鼠PaO2/FiO2、W/D及肺組織病理學評分的比較

三組大鼠的PaO2/FiO2、W/D及肺組織病理學評分比較，差異有統計學意義（P<0.001）;ALI組和BMSCs組大鼠的PaO2/FiO2低于Con組，W/D和肺組織病理學評分高于Con組，差異均有統計學意義（P<0.05）;BMSCs組大鼠的PaO2/FiO2高于ALI組，W/D和肺組織病理學評分低于ALI組，差異均有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.2三組大鼠BALF中TNF-α、IL-1α、IL-10水平及PMN的比較

三組大鼠BALF中的TNF-α、IL-1α、IL-10水平及PMN比較，差異有統計學意義（P<0.001）;ALI組和BMSCs組大鼠BALF中的TNF-α、IL-1α，IL-10水平及PMN均高于Con組，差異有統計學意義（P<0.05）;BMSCs組大鼠BALF中的TNF-α、IL-1α，PMN低于ALI組，IL-10水平高于ALI組，差異均有統計學意義（P<0.05）（表2）。

2.3三組大鼠肺組織中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達及Bcl-2/Bax的比較

三組大鼠組織中的Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達及Bcl-2/Bax比較，差異有統計學意義（P<0.001）;ALI組和BMSCs組大鼠組織中的Caspase-3、Bax蛋白表達高于Con組，Bcl-2蛋白表達和Bcl-2/Bax低于Con組，差異均有統計學意義（P<0.05）;BMSCs組大鼠的肺組織中Caspase-3、Bax蛋白表達低于ALI組，Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax高于ALI組，差異均有統計學意義（P<0.05）（表3）。

3討論

臨床上ALI以肺容積減少，肺順應性降低、通氣/血流比例失調為病理生理特點，主要表現為進行性低氧血癥和呼吸窘迫。本實驗中，給予LPS后的ALI組與Con組比較，其PaO2/FiO2下降，肺組織病理學評分升高，W/D值升高，提示造模成功;給予BMSCs的BMSCs組與ALI組比較，PaO2/FiO2上升，肺組織病理學評分下降，W/D值降低，提示BMSCs能緩解ALI所致的肺組織病理損傷，改善動脈血氧分壓。

研究顯示，ALI發病機制十分復雜，如炎性反應損傷、細胞凋亡損傷、凝血與纖溶系統失衡損傷、氧化還原失衡損傷等[9]。大量研究顯示，炎癥反應-抗炎反應失衡是ALI、ARDS的主要發病機制，即IL-10等抗炎因子分泌不足，TNF-α、IL-1α促炎因子分泌增多[10]。本實驗結果顯示，ALI組和BMSCs組大鼠BALF中的TNF-α、IL-1α及IL-10水平均高于Con組，差異有統計學意義（P<0.05）;BMSCs組大鼠BALF中的TNF-α、IL-1α，PMN低于ALI組，IL-10水平高于ALI組，差異均有統計學意義（P<0.05）。提示BMSCs能夠減輕ALI炎性因子的表達。

PMN是ALI發病機制中的關鍵效應細胞[11]，炎癥發生時，PMN因炎性因子、脂質介質、微環境的變化作為第一響應者向炎性區域聚集[12-13]，并釋放大量蛋白酶、氧自由基等破壞肺泡上皮細胞和肺毛細血管內皮細胞。ALI早期PMN凋亡延遲，同時對其他PMN產生趨化作用，引起更多的PMN聚集來破壞細胞。本實驗結果顯示，ALI組和BMSCs組大鼠BALF中的PMN高于Con組，差異有統計學意義（P<0.05）;BMSCs組大鼠BALF中的PMN低于ALI組，差異有統計學意義（P<0.05）。提示BMSCs能減少ALI時炎性細胞PMN在肺內聚集、浸潤。

炎癥反應是ALI重要的發病機制，Soliman等[14-15]大部分學者也將ALI治療方法的研究重點放在了抑制炎癥的發生上面，但越來越多的研究顯示細胞凋亡在ALI中發揮著重要作用。ALI產生的細胞因子可能抑制了炎癥細胞的凋亡，從而延長了炎性反應的過程，促進了肺泡上皮細胞的凋亡，加重了肺泡及毛細血管的損傷[16]，這些損傷性刺激又進一步誘發了細胞凋亡。Koh等[17]通過LPS刺激人肺動脈內皮細胞，檢測到了凋亡前體蛋白Caspase-3、Bax的表達均明顯增強，這些蛋白表達的增加與肺血管內皮細胞的凋亡增加一致。ALI時，肺組織產生的TNF-α、IL-1α等炎性因子誘導了肺泡上皮細胞凋亡，在此過程中，Caspase-3作為最重要的凋亡執行者，一旦活化，標志著凋亡進入不可逆階段[18]。本實驗結果顯示，ALI組和BMSCs組大鼠組織中的Caspase-3蛋白表達均高于Con組，差異有統計學意義（P<0.05），提示ALI發生時出現了細胞凋亡;BMSCs組大鼠的肺組織中Caspase-3蛋白表達低于ALI組，提示BMSCs可能減緩了凋亡的發生。

Caspase-3作為下游的凋亡執行蛋白，同時受到上游凋亡調控蛋白的影響;促凋亡蛋白Bax，主要介導線粒體內部分子進入細胞質[19]激活Caspase-3;Bcl-2是調控蛋白中重要的抗凋亡蛋白，Bcl-2蛋白表達水平的下降可能會導致細胞凋亡[20]。Bcl-2直接決定了細胞是存活還是凋亡[21]，當比值上升時，凋亡受到了抑制，反之則促進了凋亡的發生。本實驗結果顯示，ALI組和BMSCs組大鼠組織中的Bax蛋白表達高于Con組，Bcl-2蛋白表達和Bcl-2/Bax低于Con組，差異均有統計學意義（P<0.05），提示ALI中細胞凋亡參與細胞損傷，且肺損傷促進了細胞凋亡;BMSCs組大鼠的肺組織中Bax蛋白表達低于ALI組，Bcl-2蛋白表達及Bcl-2//ax高于ALI組，差異均有統計學意義（P<0.05），提示BMSCs可抑制ALI所致的細胞凋亡，且通過上調Bcl-2表達，下調Bax蛋白的表達。

綜上所述，BMSCs可抑制大鼠ALI模型的肺組織細胞凋亡，其機制可能與上調了肺組織中Bcl-2蛋白和下調Bax蛋白、Caspase-3蛋白的表達有關，為治療ALI提供了新的思路。

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（收稿日期：2019-05-31? 本文編輯：劉克明）