基于高通量測序的土壤中ermF基因宿主細菌多樣性分析

田佳 吳楠 解詩雨 黃志偉 原尚奇

摘 ? ?要：為探究土壤環(huán)境中抗生素抗性基因宿主微生物的多樣性，本研究以天津地區(qū)的農(nóng)田土壤為研究對象，利用高通量測序技術(shù)對土樣中大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermF的宿主細菌在不同分類水平的多樣性進行了評估。土樣中宿主細菌種類覆蓋9個門，39個科，42個屬。4個土樣之間所共有的OTUs只占總OTUs數(shù)目的0.5%，說明樣品間宿主細菌群落的差異性顯著，可能主要與采樣地點不同有關(guān)。在所有土樣中，ermF基因的優(yōu)勢宿主細菌在門的水平上均為擬桿菌門（Bacteroidetes，相對豐度50.3%～87.7%）;同時檢測到少量的變形菌門（Proteobacteria），放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），占比均小于4.2%。土樣中ermF優(yōu)勢宿主細菌在科水平上都為擬桿菌科（Bacteroidaceae，相對豐度50.3%～87.5%），在屬水平上都為擬桿菌屬（Bacteroides，相對豐度50.3%～87.5%），其中相對豐度大于0.1%的ermF的宿主菌屬有14種。

關(guān)鍵詞：抗生素抗性基因;土壤;高通量;多樣性

中圖分類號：S963.91 ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.11.011

Abstract： To explore the host bacteria diversity of antibiotic resistance genes in soils， the high-throughput sequencing technique were used to evaluate the diversity of host bacteria of ermF， a macrolide resistance gene， at different taxonomic levels in farmland soils in Tianjin. The bacterial species in the samples covered 9 phyla， 39 families and 42 genera. The OTUs shared by the four soil samples only accounted for 0.5% of the total number of OTUs， which indicated that the difference of host bacterial community among the samples was significant， which might be related to the different sampling sites. At phylum level， the dominant host bacteria of ermF gene were Bacteroidetes （relative abundance 50.3%～87.7%） in all soil samples; a small number of Proteobacteria， Actinobacteria and Firmicutes were also detected， accounting for less than 4.2%. The dominant host bacteria of ermF were Bacteroidaceae （relative abundance 50.3%～87.5%） at family level， and Bacteroides（relative abundance 50.3%～87.5%） at genus level. There were 14 genera of ermF host bacteria with relative abundances > 0.1%.

Key words： antibiotic resistance genes; soil; high-throughput sequencing; diversity

抗生素在禽畜集約化養(yǎng)殖等方面的廣泛應(yīng)用，帶動了畜禽養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展。但抗生素的過量使用，也帶來了一系列環(huán)境問題。長期對土壤施用殘留有抗生素的畜禽糞便，除了會造成土壤中抗生素的積累，還會加快抗生素耐藥性的傳播。抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes， ARGs），作為一種新型的環(huán)境污染物，因其能在環(huán)境中可持久性的殘留且危害特別嚴重而受到人們的廣泛關(guān)注[1]。ARGs借助于基因橫向轉(zhuǎn)移機制，可以在土壤及各個環(huán)境介質(zhì)中遷移轉(zhuǎn)化，對人類健康和生態(tài)環(huán)境帶來一定風(fēng)險。

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類弱堿性抗生素，多為堿性親脂性化合物，能不可逆地結(jié)合到細菌核糖體亞基上，通過阻斷轉(zhuǎn)肽作用及位移，選擇性抑制蛋白質(zhì)合成。ermF基因是一種常見的大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因，在污泥、畜禽糞便等環(huán)境介質(zhì)中都有檢出，且具有較高豐度[2-3]。但目前針對環(huán)境介質(zhì)中ermF基因宿主細菌多樣性的研究還較少[4]。本研究以天津地區(qū)的農(nóng)田土壤作為研究對象，利用高通量測序技術(shù)對土壤中ermF基因宿主細菌多樣性進行系統(tǒng)分析，有助于評估環(huán)境中ARGs所帶來的生態(tài)及健康風(fēng)險。

1 材料和方法

1.1 土樣采集

土壤樣品為2016年3月到5月期間采自天津的薊州（JZ），大港（DG），靜海（JH）和寶坻（BD）地區(qū)的農(nóng)田土樣。每個樣點采集表層土壤0～10 cm。

1.2 高通量測序

ermF基因的高通量測序在北京奧維森公司利用Illumina MiSeq平臺進行。土壤DNA提取采用Power Soil DNA Isolation Kit試劑盒 （MoBio， USA）。表1列出了ermF基因擴增所用引物和退火溫度[5]。

1.3 生物信息學(xué)和統(tǒng)計分析

首先，對原始測序數(shù)據(jù)進行過濾處理，過濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控后50 bp以下的reads;然后根據(jù)reads的overlap關(guān)系將成對的序列拼接成一條序列，最小overlap長度為10 bp，拼接允許的最大錯配比率為0.1。根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，barcode允許的錯配數(shù)為0。用Usearch軟件去除嵌合體，通過Mothur去掉長度較小的tags[6]。在0.97相似度下利用UCLUST軟件將拼接過濾后的序列聚類用于物種分類的OTUs（operational taxonomic units）。樣品中每個OTU的代表性序列，通過BLAST工具與NCBI NR數(shù)據(jù)庫進行比對，得到對應(yīng)物種分類信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 宿主細菌群落多樣性分析

4個土樣進行測序后共獲得285 234條高質(zhì)量序列，優(yōu)質(zhì)序列長度集中在 240～300 bp。測序覆蓋深度（Coverage指數(shù)）均在0.99以上，說明測序結(jié)果代表了樣本中微生物的真實情況。各樣品的稀釋曲線能在一定程度上反映不同樣品菌群多樣性。由圖1可以看出， JZ、DG和BD的稀釋曲線已經(jīng)趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)足以覆蓋所有的微生物。JH的稀釋曲線雖然趨于平緩，但仍未達到平臺期，說明測序量仍有部分的宿主細菌群不能夠被覆蓋，如果增大測序量，仍然有可能發(fā)現(xiàn)新的OTUs[6]。

Shannon指數(shù)指示了樣品的細菌多樣性的豐富程度，數(shù)值越高，表明細菌群落的物種多樣性越高，分布越均勻。JZ土樣的Shannon指數(shù)為3.87，遠高于其他3個土樣（DG：1.48;JH：1.79;BD：1.43）。這表明在4個土樣中，JZ土樣中的ermF基因宿主細菌群落的多樣性程度最高。

2.2 OTUs分布維恩圖

圖2 直觀地展現(xiàn)了4個土樣中所共有和獨有的OTUs 數(shù)目及重疊情況。4個土樣中所共有的OTUs只有3個，占總OTUs數(shù)目（555個）的0.5%。除BD土樣外，其余3個土樣各自獨有OTUs數(shù)目均超過100個。結(jié)果表明所測土樣之間宿主細菌群落的差異性明顯。

2.3 在門水平上的群落豐度分析

由圖3可知，4個土樣中共分離得到9個微生物菌門，其中相對豐度小于0.1%的菌門歸為其他類。在門類水平上，所有土樣中ermF的宿主優(yōu)勢菌都為擬桿菌門（Bacteroidetes），其中DG，JH和BD土樣中擬桿菌門占75.7%～87.7%，而在JZ土樣中比例較低，約占50.3%。此外，ermF的優(yōu)勢宿主菌還有變形菌門（Proteobacteria），在JZ和JH土樣中分別占4.1%和3.9%，而在其余土樣中占比都小于0.5%。JZ土樣中還檢測到了少量的放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），相對豐度分別為0.7%和0.2%。

2.4 在科水平上的群落豐度分析

土樣中共檢測得到39個微生物菌科，其中相對豐度小于0.1%的菌科歸為其他類。由圖4可知，所有土樣中ermF的宿主優(yōu)勢菌在科水平上都為擬桿菌科（Bacteroidaceae），相對豐度為50.3%～87.5%。JZ土樣中的多囊粘菌科（Polyangiaceae）、葉桿菌科（Phyllobacteriaceae）和丙酸桿菌科（Propionibacteriaceae）的相對豐度較高，分別為1.6%，0.9%和0.4%。在JH土樣中也檢測到了較高豐度的葉桿菌科，相對豐度為3.6%。在BD土樣中檢測到較高豐度的紫單胞菌科（Porphyromonadaceae），相對豐度為1.1%。其他微生物菌科在4個土樣中所占比例極少，均低于0.4%。

2.5 在屬水平上的群落豐度分析

土樣中共分離得到42個微生物菌屬。圖5顯示了在屬水平上的ermF基因宿主細菌群落相對豐度熱圖，其中相對豐度小于0.1%的菌屬歸為其他類。在JZ樣品中，ermF基因的宿主細菌中占比最多的3種菌屬分別為擬桿菌屬（Bacteroides，相對豐度50.3%），黏細菌屬（Chondromyces，相對豐度1.6%）和根瘤菌屬（Mesorhizobium，0.9%）。在其他3個土樣中，ermF基因的宿主細菌中占比最多的同樣為擬桿菌屬（相對豐度75.7%～87.5%）。在JH土樣中檢測到較高豐度的根瘤菌屬（3.6%）。此外，巴氏桿菌屬（Barnesiella）在所有土樣中都被檢測到，其中BD土樣中的巴氏桿菌屬的相對豐度最高（1.1%）。值得注意的是，許多宿主菌屬只在JZ土樣中檢測到（相對豐度0.1%～0.4%），而沒有出現(xiàn)在其他3個土樣中，如原囊菌屬（Archangium），固氮螺菌屬（Azospirillum），克洛諾菌屬（Cronobacter），鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas），葡萄球菌屬（Staphylococcus）和硫針菌屬（Sulfuritalea）。這表明JZ土樣中的ermF的宿主細菌落多樣性較高，這與之前的Shannon指數(shù)結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

本研究通過高通量測序技術(shù)，對天津地區(qū)的農(nóng)田土壤中大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermF的宿主細菌在不同分類水平的多樣性進行了分析。4個土樣中ermF基因的宿主細菌種類覆蓋9個門，39個科，42個屬。4個土樣之間所共有的OTUs只占總OTUs數(shù)目的0.5%，說明樣品間宿主細菌群落的差異性明顯，這可能主要與采樣地點不同有關(guān)。在所有土樣中，ermF基因的優(yōu)勢宿主細菌在門的水平上均為擬桿菌門（Bacteroidetes，相對豐度50.3%～87.7%）;同時檢測到少量的變形菌門（Proteobacteria），放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），占比均小于4.2%。土樣中ermF優(yōu)勢宿主細菌在科水平上都為擬桿菌科（Bacteroidaceae，相對豐度50.3%～87.5%），在屬水平上均為擬桿菌屬（Bacteroides，相對豐度50.3%～87.5%）。這與前人研究結(jié)果一致，Eitel等[7]曾報道在擬桿菌的菌株中檢測到高豐度的ermF基因。Johnsen等[8]發(fā)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因（erm）通常存在于擬桿菌屬中。在42個ermF宿主菌屬中，相對豐度大于0.1%的菌屬有14個。Zhang 等[9]報道在污泥堆肥體系中，ermF基因的潛在宿主菌屬高達24個，其中如葡萄球菌屬（Staphylococcus）和假單胞菌屬（Pseudomonas），在本研究中也被檢測到。和JZ土樣相比，其他土樣中的擬桿菌屬的占比增加，造成這一現(xiàn)象的原因可能與采樣地點不同，土壤的基本理化性質(zhì)差異有關(guān)。例如有研究表明擬桿菌屬在富營養(yǎng)環(huán)境中能夠更好地存活[10]。環(huán)境因子對于ermF宿主細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響還需進一步研究。本文結(jié)果為探索抗生素抗性基因宿主細菌的多樣性提供了科研依據(jù)與基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]WU N， QIAO M， ZHANG B， et al. Abundance and diversity of tetracycline resistance genes in soils adjacent to representative swine feedlots in China[J]. Environmental science & technology， 2010， 44： 6933-9.

[2]韋蓓， 黃福義， 李虎， 等. 污泥堆肥過程中磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因的殘留[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報， 2014， 20（3）： 395-400.

[3]鄭寧國， 黃南， 王衛(wèi)衛(wèi)， 等.高溫堆肥過程對豬糞來源抗生素抗性基因的影響[J].環(huán)境科學(xué)，2016， 37（5）： 1986-1992.

[4]CHUNG W O， WERCKENTHIN C， SCHWARZ S， et al. Host range of the ermF rRNA methylase gene in bacteria of human and animal origin[J]. Journal of antimicrobial chemotherapy， 1999， 43（1）： 5-14.

[5]CHEN J， YU Z， MICHEL F C， et al. Development and aplication of real-time PCR assays for quantification of erm genes conferring resistance to macrolides-lincosamides-streptogramin B in livestock manure and manure management systems[J]. Applied and environmental microbiology， 2007， 73（14）： 4407-4416.

[6]周美麗， 王立志， 閆天海， 等. 林麝糞便細菌多樣性研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2016， 21（2）： 100-106.

[7]EITEL Z， SOKI J， URBAN E， et al. The prevalence of antibiotic resistance genes in Bacteroides fragilis group strains isolated in different European countries[J]. Anaerobe， 2013， 21： 43-49.

[8]JOHNEN B O， HANDAL N， MEISAL R， et al. erm gene distribution among Norwegian Bacteroides isolates and evaluation of phenotypic tests to detect inducible clindamycin resistance in Bacteroides species[J]. Anaerobe， 2017， 47： 226-232.

[9]ZHANG J， CHEN M， SUI Q， et al. Impacts of addition of natural zeolite or a nitrification inhibitor on antibiotic resistance genes ?during ?sludge composting[J]. Water research， 2016， 91： 339-349.

[10]WANG M， LIU P， XIONG W， et al. Fate of potential indicator antimicrobial resistance genes （ARGs） and bacterial community diversity in simulated manure-soil microcosms[J]. Ecotoxicology and environmental safety， 2018， 147： 817-823.