新輔助化療后Ki-67表達(dá)變化及其與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

陳 萌 路洪超 劉 鑠

(1 河北省民政總醫(yī)院普通外科，邢臺(tái)市 054000，電子郵箱：cmeng821028@sina.com；2 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺中心，石家莊市 051000)

近年來(lái)，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性的身心健康[1]。新輔助化療可以消除全身微轉(zhuǎn)移灶，提高保乳率，且化療后患者可獲得病理完全緩解，提高生存率，目前已成為局部晚期乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)化治療方案之一[2]。隨著分子生物學(xué)研究的發(fā)展,乳腺癌相關(guān)生物學(xué)因子表達(dá)在乳腺癌新輔助化療效果及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值越來(lái)越受重視。研究顯示，Ki-67是評(píng)價(jià)乳腺癌新輔助化療效果的敏感性指標(biāo)[3]，乳腺癌組織中Ki-67高表達(dá)提示腫瘤增殖活躍，預(yù)后不良。本研究觀察新輔助化療后Ki-67表達(dá)變化及其與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2007年1月至2010年1月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺中心，行新輔助化療的185例初治Ⅱb～Ⅲc期乳腺癌患者的臨床資料，均為女性，年齡29～71歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：化療前經(jīng)空芯針活檢槍穿刺活檢確診為乳腺癌；影像學(xué)檢查提示無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；新輔助化療后均行根治性手術(shù)治療；既往無(wú)針對(duì)腫瘤的放療、化療及內(nèi)分泌治療史；無(wú)化療禁忌證。排除標(biāo)準(zhǔn)：已存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、合并其他腫瘤、不配合治療者。年齡≤35歲共13例(7.0%)，>35歲共172例(93.0%)；絕經(jīng)103例(55.6%)；腫瘤<2 cm共26例(14.1%)，2～5 cm共105例(56.8%)，>5 cm共54例(29.2%)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移共125例(67.6%)；分子分型：Luminal A型共50例(27.0%)，Luminal B型共28例(15.1%)，三陰型共52例(28.1%),人表皮生長(zhǎng)因子受體(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)過(guò)表達(dá)型共55例(29.7%)。

1.2 治療方法 根據(jù)患者年齡、病理類型、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，再結(jié)合患者的心臟狀況，經(jīng)濟(jì)狀況等選擇不同的化療方案。新輔助化療方案包括含蒽環(huán)類藥物治療方案與紫杉類聯(lián)合蒽環(huán)類藥物治療方案。兩種方案均治療3～4個(gè)周期。含蒽環(huán)類藥物治療方案：環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞有限公司，批號(hào)：100514AM)500 mg/m2、表柔比星(浙江海正有限公司，批號(hào)：10017811)100 mg/m2或吡柔比星(深圳萬(wàn)樂(lè)有限公司，批號(hào)：08110925)60 mg/m2，于每一治療周期第1天靜脈注射，1次/周期，每21天為1個(gè)周期。紫杉類聯(lián)合蒽環(huán)類藥物治療方案為TE或TEC方案：(1)TE方案。表柔比星75 mg/m2，于每一治療周期第1天靜脈注射，紫杉醇(揚(yáng)子江藥業(yè)有限公司，批號(hào)：9L0714866)175 mg/m2或多西他賽(齊魯制藥有限公司，批號(hào)：8D0071649)75 mg/m2，于每一治療周期第2天靜脈注射；(2)TEC方案。在TE方案的基礎(chǔ)上，給予環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞有限公司，批號(hào)：090174TM)500 mg/m2，于每一治療周期第1天靜脈注射，1次/周期，每21天為1個(gè)周期。

1.3 Ki-67的檢測(cè)方法與結(jié)果判定 在化療前及化療4個(gè)周期后，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法檢測(cè)患者乳腺癌組織Ki-67表達(dá)水平，其中兔抗人Ki-67(克隆號(hào)：MIB-1)單克隆抗體購(gòu)自福州邁新有限公司(批號(hào)：09061306)，生物素標(biāo)記的二抗試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司(批號(hào)：09072404)。將腫瘤組織石蠟標(biāo)本切4 μm厚切片置于載玻片上，置于60℃恒溫箱2 h后放置于37℃恒溫箱固片。將切片常規(guī)脫蠟：先用二甲苯洗浴10 min/次(共2次)，再經(jīng)100%乙醇洗浴5 min/次(共2次)，95%、80%梯度乙醇各洗浴5 min，清水沖洗2次，蒸餾水洗浴3 min。然后進(jìn)行抗原熱修復(fù)，蒸餾水洗浴2 min/次(共3次)，將切片組織置于抗原修復(fù)液平面以下，蓋鍋壓閥。加熱5～6 min后，自開始噴氣時(shí)，計(jì)時(shí)2.5～3.0 min，停止加熱，然后將壓力鍋冷水降至室溫，取出切片后先后蒸餾水、磷酸鹽緩沖液沖洗，各2 min/次(共3次)，3%過(guò)氧化氫室溫孵育5～10 min，再以磷酸鹽緩沖液沖洗2 min/次(共3次)；滴加一抗，置于4℃冰箱過(guò)夜；磷酸鹽緩沖液洗浴2 min/次(共3次)；滴加二抗，室溫下孵育20 min，磷酸鹽緩沖液沖洗2 min/次(共3次)；滴加3,3-二氨基聯(lián)苯溶液顯色，顯微鏡下觀察，適度顯色時(shí)終止顯色反應(yīng)；充分水洗，蘇木素復(fù)染；經(jīng)梯度乙醇脫水，樹膠封，鏡下閱片。采用已知為陽(yáng)性染色切片作陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液作陰性對(duì)照。Ki-67為核表達(dá)，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性標(biāo)志。判斷標(biāo)準(zhǔn)如下[4]：Ki-67陰性(-)，即無(wú)棕黃色染色或染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%；Ki-67陽(yáng)性(+)，即染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在10%～25%；Ki-67陽(yáng)性(2+)，即染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在26%～50%；Ki-67陽(yáng)性(3+)，即染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在>50%。對(duì)乳腺癌進(jìn)行分子分型時(shí)，Ki-67染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥14%即為陽(yáng)性，Ki-67染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<14%即為陰性。

1.4 乳腺癌分子分型[5]依據(jù)免疫組化結(jié)果中雌激素受體(estrogen receptor，ER)/孕激素受體(progesterone receptor，PR)、HER-2和Ki-67表達(dá)水平的不同將乳腺癌分為4個(gè)亞型：Luminal A型(ER/PR陽(yáng)性，Ki-67<14%，HER-2陰性)、Luminal B型包括[Luminal B1型(ER/PR陽(yáng)性,Ki-67≥14%，HER-2陰性)和Luminal B2型(ER/PR陽(yáng)性，HER-2陽(yáng)性，Ki-67任何表達(dá)水平)]、HER-2過(guò)表達(dá)型(ER陰性，PR陰性，HER-2陽(yáng)性，Ki-67任何表達(dá)水平)、和三陰性型(ER陰性，PR陰性，HER-2陰性，Ki-67任何表達(dá)水平)。

1.5 隨訪 隨訪截至2015年1月，隨訪方式為電話隨訪和門診復(fù)診。隨訪內(nèi)容包括：(1)是否繼續(xù)接受內(nèi)分泌治療、分子靶向治療等；(2)是否定期復(fù)查，以及生存狀況；(3)死亡患者明確死亡原因是否與乳腺癌相關(guān)。無(wú)復(fù)發(fā)生存(relapse-free survival，RFS)是指從術(shù)日起至首次診斷復(fù)發(fā)、死亡，或隨訪日期為止。RFS率=隨訪期內(nèi)無(wú)復(fù)發(fā)或死亡的例數(shù)/總例數(shù)×100%

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料用(x±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以[M(P25，P75)]表示，比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分?jǐn)?shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，兩組中位RFS時(shí)間比較采用log-rank檢驗(yàn)。以化療前Ki-67表達(dá)水平為基準(zhǔn)，化療后Ki-67水平低于化療前為降低，高于化療前為升高。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Ki-67變化與分子分型的關(guān)系 185例患者化療后Ki-67表達(dá)水平低于化療前。其中Luminal B型、三陰性型、HER-2過(guò)表達(dá)型患者化療后Ki-67表達(dá)水平均低于化療前(均P<0.05)，而Luminal A型患者化療前后Ki-67表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 Ki-67變化與預(yù)后的關(guān)系 術(shù)后隨訪期間，185例患者中復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移46例，死亡11例，無(wú)復(fù)發(fā)生存128例。化療后Ki-67表達(dá)水平降低共133例，其中RFS 99例，RFS率為74.4%，中位RFS時(shí)間為71個(gè)月；未降低共52例，其中RFS 29例，RFS率為55.8%，中位RFS時(shí)間為57個(gè)月。Ki-67降低者RFS時(shí)間高于Ki-67未降低者(χ2=9.409，P=0.002)。見圖1。

表1 各分子分型和總體患者新輔助化療前后Ki-67表達(dá)比較[M(P25，P75)，%]

2.3 乳腺癌各分子亞型中Ki-67變化與預(yù)后的關(guān)系 Luminal A型患者50例，化療后Ki-67表達(dá)水平降低者29例，RFS率為79.3%(23/29)，中位RFS時(shí)間為75個(gè)月；未降低者21例，RFS率為71.4%(15/21)，中位RFS時(shí)間為68個(gè)月；Ki-67表達(dá)水平降低者和未降低者之間RFS時(shí)間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.649，P=0.420)，見圖2。Luminal B型患者28例，Ki-67表達(dá)水平降低者24例，RFS率為75.0%(18/24)，中位RFS時(shí)間為72個(gè)月；未降低者4例，RFS率為25.0%(1/4)，中位RFS時(shí)間為36個(gè)月；Ki-67表達(dá)水平降低者RFS時(shí)間高于未降低者(χ2=7.598，P=0.006)，見圖3。三陰性型患者52例，Ki-67表達(dá)水平降低者38例，RFS率為65.8%(25/38)，中位RFS時(shí)間為65個(gè)月；未降低者14例，RFS率為42.6%(6/14)，中位RFS時(shí)間為39個(gè)月；Ki-67表達(dá)水平降低者RFS時(shí)間高于未降低組(χ2=4.546，P=0.033)，見圖4。HER-2過(guò)表達(dá)型患者55例，Ki-67表達(dá)水平降低者42例，RFS率為78.6%(33/42)，中位RFS時(shí)間為74個(gè)月；未降低者13例，RFS率為53.8%(7/13)，中位RFS時(shí)間為59個(gè)月；Ki-67表達(dá)水平降低者RFS時(shí)間高于未降低者(χ2=3.973，P=0.046)，見圖5。

圖1 185例患者RFS曲線 圖2 Luminal A型患者RFS曲線

圖3 Luminal B型患者RFS曲線 圖4 三陰型患者RFS曲線

圖5 HER-2過(guò)表達(dá)型患者RFS曲線

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。早在20世紀(jì)60年代,就有學(xué)者提出乳腺癌是一種全身性疾病[6]。新輔助化療于1982年首次被提出,指在手術(shù)前或放療前進(jìn)行的全身性、系統(tǒng)性細(xì)胞毒性藥物治療[7]。對(duì)于具有適應(yīng)證的乳腺癌患者，實(shí)施新輔助化療可使其獲益，目前已達(dá)成共識(shí)[8]。然而，目前用于預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效及預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)，仍然沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),探討有關(guān)新輔助化療療效及預(yù)后的預(yù)測(cè)因子成為臨床關(guān)注的熱點(diǎn)[9]。

Ki-67是目前檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖活性最可靠的指標(biāo)之一[10]。研究表明，Ki-67在乳腺癌的診治與預(yù)后評(píng)估中均具有重要的臨床價(jià)值，其表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)乳腺癌對(duì)新輔助化療的反應(yīng)以及選擇化療方案的重要分子生物學(xué)指標(biāo)[11-12]。本研究結(jié)果顯示，185例患者化療后Ki-67表達(dá)水平低于化療前，化療后Ki-67表達(dá)降低組患者RFS率為70.6%，未降低患者RFS率為55.0%，Ki-67表達(dá)水平降低組RFS率高于未降低組(P<0.05)，即化療后Ki-67表達(dá)水平降低者有預(yù)后較好，與Focke等[13]研究結(jié)果相似。這提示化療后Ki-67表達(dá)水平的高低對(duì)評(píng)價(jià)乳腺癌細(xì)胞的增殖狀態(tài)、腫瘤的生物學(xué)行為、判斷其遠(yuǎn)期生存具有重要意義。

Chen等[14]對(duì)225例接受新輔助化療的局部晚期乳腺癌患者進(jìn)行隨訪，發(fā)現(xiàn)相較于Luminal A型與Luminal B型乳腺癌患者，三陰型和HER-2過(guò)表達(dá)型乳腺癌患者病理完全緩解率更高，但預(yù)后相對(duì)更差。目前，對(duì)于新輔助化療后不同乳腺癌分子亞型患者Ki-67表達(dá)水平變化與預(yù)后的關(guān)系，鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，在Luminal A型患者中，化療后Ki-67降低者和未降低者之間RFS率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在Luminal B型、三陰性型和HER-2過(guò)表達(dá)型患者中，化療后Ki-67表達(dá)水平降低者RFS率均高于未降低者(均P<0.05)，提示在Luminal B型、三陰性型和HER-2過(guò)表達(dá)型乳腺癌患者中，新輔助化療前后Ki-67表達(dá)水平的變化可能是乳腺癌患者預(yù)后的影響因素。但本研究樣本量較小,有待在擴(kuò)大樣本量以進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)論。此外，本研究未將患者是否接受內(nèi)分泌及抗HER-2治療考慮在內(nèi)，而這可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生一定影響，亟待行多因素分析研究進(jìn)行更加深入的探討。