重慶市榮昌區(qū)動(dòng)物源沙門(mén)菌的檢測(cè)與耐藥性分析

牟 豪 余遠(yuǎn)迪 翟少欽

重慶市畜牧科學(xué)院，重慶榮昌402460

沙門(mén)菌是一種重要的人獸共患病病原菌，血清型眾多且宿主廣泛，不僅可以感染人，還能感染畜禽類(lèi)動(dòng)物及野生動(dòng)物[1]，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，沙門(mén)菌可以通過(guò)食物鏈傳遞給人類(lèi)，最終導(dǎo)致人類(lèi)發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)[2]。目前，在我國(guó)畜禽業(yè)養(yǎng)殖過(guò)程中，抗菌藥物不僅被用來(lái)治療由細(xì)菌引起的各種疾病，而且部分抗菌藥物還被用作預(yù)防動(dòng)物疾病和動(dòng)物促生長(zhǎng)劑。這可能導(dǎo)致臨床分離株加速成為多重耐藥株，給臨床治療帶來(lái)難度[3]。

本研究從位于重慶市榮昌區(qū)的畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)中分離得到沙門(mén)菌臨床分離株，并對(duì)其血清型和藥物敏感性進(jìn)行分析，以期為榮昌區(qū)畜禽源沙門(mén)菌的耐藥規(guī)律提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)以及指導(dǎo)臨床合理用藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1）樣品來(lái)源。樣品為2018年10月至2018年11月采集于重慶市榮昌區(qū)的一家規(guī)?；i養(yǎng)殖場(chǎng)的80 份豬糞便和一家肉鵝養(yǎng)殖場(chǎng)的30 份鵝糞便。所有樣品為健康豬和鵝的新鮮糞便。采集的樣品均置于有冰袋的泡沫箱中，6 h 之內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。共采集樣品110 份。

2）主要試劑。緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、XLD 瓊脂（海博生物技術(shù)有限公司）；革蘭氏染色液、藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）；沙門(mén)菌診斷血清（寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司）。所有試劑和培養(yǎng)基均在有效期內(nèi)并經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。

1.2 方法

1）樣品的處理。樣品經(jīng)BPW 前增菌和TTB 選擇性增菌后，將菌液劃線(xiàn)接種于XLD 平板，37℃培養(yǎng)18～24 h。每個(gè)平板挑取3～5個(gè)透明、中心帶有黑點(diǎn)或不帶黑點(diǎn)的疑似沙門(mén)菌菌落劃線(xiàn)于LB 平板，37℃培養(yǎng)20 h。挑取單個(gè)菌落，革蘭染色，觀察細(xì)菌形態(tài)。

2）臨床菌株的PCR檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)與合成：參考國(guó)標(biāo)GB/T 28642-2012《飼料中沙門(mén)菌的快速檢測(cè)方法-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法》中擴(kuò)增沙門(mén)菌特異性基因invA。invA-F：5'-TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGC-3’和invA-R：5'-GCATTATCGATCAGTACCAGCCGTCT-3'。分離菌株的PCR鑒定：水煮法提取菌液DNA，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×Taq Mix 12.5 μL，invA-F（10 μmol/L）1 μL，invA-R（10 μmol/L）1 μL，模板DNA 2 μL，dd H2O 8.5 μL，總反應(yīng)體系25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸6 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。以沙門(mén)菌ATCC 25923 作為陽(yáng)性對(duì)照。

3）沙門(mén)菌的血清型鑒定。將分離鑒定的沙門(mén)菌分離株在LB 平板上劃線(xiàn)培養(yǎng)18～24 h，作為玻片凝集試驗(yàn)用的抗原。首先，在平板上挑取1個(gè)單菌落與1 滴生理鹽水混合均勻，觀察是否有凝集反應(yīng)，然后對(duì)無(wú)自凝性的沙門(mén)菌進(jìn)行血清學(xué)鑒定。其次，采用沙門(mén)菌診斷血清進(jìn)行沙門(mén)菌多價(jià)菌體抗原（O）的鑒定，再對(duì)多價(jià)鞭毛抗原（H）進(jìn)行鑒定。對(duì)照Kauffmann-White 抗原表判定沙門(mén)菌血清型。

4）藥物敏感性試驗(yàn)。根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLST）抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，采用K-B紙片法對(duì)沙門(mén)菌臨床分離株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。以沙門(mén)菌ATCC 25923 作為質(zhì)控菌株。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離

本研究在110 份樣品中，通過(guò)選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)和增菌，并通過(guò)PCR鑒定共分離到沙門(mén)菌8 株（圖1），分離率為7.3%（表1）。其中在豬場(chǎng)分離到6 株，在肉鵝場(chǎng)分離到2 株，分離率分別為7.5%和7.3%。

圖1 沙門(mén)菌特異性基因invA的檢測(cè)

表1 沙門(mén)菌分離鑒定情況

2.2 沙門(mén)菌血清型

此次分離的8 株沙門(mén)菌中，其中7 株可以通過(guò)沙門(mén)菌鑒定血清鑒定其血清型，有1 株鵝源沙門(mén)菌無(wú)法鑒定其血清型。已經(jīng)鑒定的7 株沙門(mén)菌均為血清群B 群，分別為鼠傷寒沙門(mén)菌5 株、乙型副傷寒沙門(mén)菌1 株和圣保羅沙門(mén)菌1 株。5 株鼠傷寒沙門(mén)菌中，4 株為豬源沙門(mén)菌，1 株為鵝源沙門(mén)菌。另外，1 株乙型副傷寒沙門(mén)菌和1 株圣保羅沙門(mén)菌分別為豬源和鵝源沙門(mén)菌（表2）。從血清型分布情況來(lái)看，鼠傷寒沙門(mén)菌是最常見(jiàn)的血清型（5 株，占總數(shù)的62.5%）。

表2 不同動(dòng)物源沙門(mén)菌血清型的分布情況

2.3 藥物敏感性

從表3可知，本次從豬和肉鵝中分離到的沙門(mén)菌對(duì)8 大類(lèi)抗菌藥物中的7 大類(lèi)抗菌藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥。其中，分離株對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗菌藥物的耐藥現(xiàn)象最為嚴(yán)重，耐藥率高達(dá)100%。其次，酰胺醇類(lèi)、青霉素類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)中的鏈霉素和慶大霉素的耐藥也較為嚴(yán)重，耐藥率均大于75%，尤其是鏈霉素，耐藥率更是高達(dá)100%。此外，頭孢菌素類(lèi)中，頭孢氨芐的耐藥情況比較嚴(yán)重，耐藥率為62.5%。本次試驗(yàn)的8 株沙門(mén)菌分離株未發(fā)現(xiàn)對(duì)磺胺類(lèi)藥物耐藥。

2.4 多重耐藥分析

由圖2可知，該8 株沙門(mén)菌臨床分離菌株均為多重耐藥菌株，多重耐藥率高達(dá)100%。從多重耐藥菌株的分布情況來(lái)看，耐抗菌藥物數(shù)量從6～17種不等。耐6種、7種和8種抗菌藥物的沙門(mén)菌分離株均為2 株。分別有1 株鵝源和豬源沙門(mén)菌對(duì)16種和17種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。

表3 豬源沙門(mén)菌和鵝源沙門(mén)菌的耐藥情況

圖2 不同動(dòng)物源沙門(mén)菌分離株的多重耐藥情況

3 討論

沙門(mén)菌是重要的人畜共患腸道病原菌，豬感染致病性沙門(mén)菌后會(huì)導(dǎo)致豬患副傷寒、腸炎或腹瀉等疾病。肉鵝感染致病性沙門(mén)菌后臨床表現(xiàn)為下痢、結(jié)膜炎和消瘦[4]。劉麗娟等[5]在2018年報(bào)道了來(lái)自于腹瀉仔豬的腸道沙門(mén)菌的分離率為22.7%。焦連國(guó)等[6]從我國(guó)多個(gè)省份的仔豬腹瀉樣品中分離到的沙門(mén)菌的平均分離率為11.56%，其中，在重慶地區(qū)的分離率高達(dá)42.9%。這些研究結(jié)果都遠(yuǎn)高于本試驗(yàn)的豬源沙門(mén)菌的分離率，這可能是由于豬腹瀉樣本受沙門(mén)菌感染的可能性很高，同時(shí)沙門(mén)菌的分離率還與不同區(qū)域、采集季節(jié)、培養(yǎng)方式、分離方式以及環(huán)境條件相關(guān)。

從耐藥情況來(lái)看，沙門(mén)菌分離株對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗菌藥物的耐藥現(xiàn)象最為嚴(yán)重，其次為酰胺醇類(lèi)、青霉素類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)。這可能與養(yǎng)殖場(chǎng)在日常的飼養(yǎng)管理和疾病預(yù)防中經(jīng)常使用該類(lèi)抗生素有關(guān)。值得注意的是，本研究分離的沙門(mén)菌均為多重耐藥株。在今后的畜禽生產(chǎn)中應(yīng)該合理地使用抗菌藥物，避免菌株多重耐藥現(xiàn)象的發(fā)生給養(yǎng)殖業(yè)和人類(lèi)健康造成巨大危害。