不同月齡階段關嶺牛MYH3和MYH4基因mRNA表達水平的研究

覃 海 楊沛方 陳 偉 許厚強 陳 祥 周 萍 秦 媛 范 瑞

高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室/貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室/貴州大學動物科學學院，貴陽550025；

關嶺牛因其主要產區在關嶺自治縣而得名，與陜西秦川牛、山西晉南牛、山東魯西牛和東北地區延邊牛并稱“中國五大名牛”，其主要的集中區域是盤江流域附近，同時關嶺牛也是屬于國家級別的重點保護畜禽之一。對于關嶺牛而言，其擁有的5個特質主要是：擁有較高的出肉率且脂肪含量低、蛋白質和氨基酸含量高，同時繁殖率和屠宰率較高，以眾多優點被評為貴州省地方性優良品種，塑造了“一生鮮草、一碗好肉”的良好品牌形象。

對于動物肌肉而言，其主要的成分蛋白是肌球蛋白。肌球蛋白在總體蛋白的比例為15%～25%，是一種非常保守的蛋白。在肌肉收縮、物質的運輸工作等生理活動中均發現了肌球蛋白[1]。在分子結構水平上脊椎動物的肌球蛋白長度約為160 nm，同時還表現出了如同字母“Y”的形狀，但并非對稱結構[2]。肌球蛋白重鏈及輕鏈共同組成了肌球蛋白，也就是MYH 以及MLC，在這當中有2 條重鏈，分子質量在220 kμ 左右，而其中有4 條是輕鏈，分子質量在16～20 kμ 之間[3]。MYH 有850個氨基酸殘基存在于N 端，并共同組成了球形頭部，而MYH的尾部由C 端構成[4]。如果對球形頭部進行劃分，可大體上劃分為3個主要功能區間，ATP的結合點在N 端的23 K，ATP 酶活性的激發是由第88個氨基酸所控制[5]，掌握肌肉收縮的是50K 區域，而肌動蛋白的結合位點是50K 區域。對于肌肉分化有主要影響的結構基因是MYH基因[6]。

MYH基因是控制肌肉發生分化的主要結構基因之一，基因的轉錄表達分析通常選用看家基因作為內參[7]。本研究以GAPDH作為內參基因，采用實時熒光定量PCR方法研究關嶺牛MYH3和MYH4基因mRNA在不同發育階段的表達水平，旨在為研究MYH3和MYH4基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本試驗的試驗動物是關嶺牛，在貴州省安順市西秀區幺鋪鎮關嶺牛養殖場，挑選9 頭關嶺牛，選取其小腸、肝臟、肌肉、心臟、脂肪組織等，其中胎兒3 頭、18月齡3 頭、30月齡3 頭，用碳酸二乙酯洗滌組織以去除表面血液，使用錫箔包好，放入液氮中，隨后將其儲存在-80℃冰箱中。

1.2 主要試劑

1.3 總RNA提取和cDNA合成

取50mg 組織樣于液氮中研磨到只有米粒一般大小后，利用Tr-izol 法對關嶺牛組織樣品的總RNA進行提取，并選用微量分光光度檢測其濃度與純度。為了檢測RNA是否完整，應該使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳。按照TransStartOne-Step gDNA Removal and cDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 反轉錄試劑盒操作說明進行反轉錄得到cDNA，反應體系見表1。25℃10 min 后，42℃30 min，85℃5 min，-20℃保存備用。

1.4 引物設計及熒光定量PCR

根據Genbank 登錄的相關基因序列，結合Primer 5.0 軟件分析，設計GAPDH、MYH3和MYH4基因特異性實時熒光定量PCR引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列見表2。

表1 反轉錄體系

實時熒光定量PCR反應是以cDNA 為模板，采用10 μL 反應體系（表3），整個分析過程是定量的，采用熒光定量PCR儀（CFX96，Bio-Rad，USA）。GAPDH作為內參基因，得到優化以后，其反應條件最佳為：在50℃條件下，孵育2 min，并在94℃的條件下預先變性5 min，并在該條件下進行30 s的變性，最后進行30 s的退火操作（退火所需溫度如表2 所示），繼而在72℃條件下進行30 s的延伸。需要進行檢測的平行樣品數為3個。當反應完成以后，可通過熔解曲線對PCR的反應特性進行研究判斷，僅僅進行判斷是不可行的，必須依據相應的定量分析結果，而其結果還需要依照標準曲線及Ct值的計算獲取。

表2 實時熒光定量PCR擴增引物序列及參數

1.5 數據分析

在本次試驗方案中，將GAPDH基因作為內參基因，并通過SPSS 18.0 軟件對樣品進行Ct平均值及標準偏差的計算工作。應用2-△△CT法處理數據，研究在不同年齡階段的MYH3基因以及MYH4基因mRNA的表達情況。

2 結果與分析

2.1 RNA提取與RT-PCR結果分析

總RNA通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳，發現其有著清晰的不同條帶（圖1），適用于逆轉錄。用MYH3基因、MYH4基因和GAPDH基因引物先在普通PCR儀上進行PCR擴增，檢測是否為目的條帶。

2.2 熒光定量PCR產物特異性分析

圖1 總RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

本試驗對MYH3基因和MYH4基因在關嶺牛不同月齡中的表達量進行了分析，結果發現，對于GAPDH、MYH3和MYH4基因，其擴增曲線呈現S型（分別見圖2和圖3），這說明GAPDH、MYH3和MYH4基因有著較好的平行性，且其拐點十分明顯，在基線上沒有明顯的上升發展，梯度模版熔解曲線比較緊密（分別見圖4和圖5）。且只存在1個顯著的峰，這說明實際的特定增產物造成熒光的強度。實時熒光定量PCR時，內參及目標基因不會發生非特異性擴增和引物二聚體，因此以后試驗仍可用。

2.3 MYH3和MYH4基因在關嶺牛不同發育時期mRNA表達水平的分析

圖6 為MYH3和MYH42個基因mRNA在關嶺牛不同年齡的表達，可以看出表達MYH3基因和MYH4基因mRNA最高的是30月齡的背最長肌，然后為18月齡的背最長肌，而胎兒中的背最長肌表達量則非常少。

圖2 GAPDH基因的擴增曲線

圖3 MYH3基因和MYH4基因的擴增曲線

圖4 GAPDH基因的熔解曲線

圖5 MYH3基因和MYH4基因的熔解曲線

圖6 MYH3和MYH4基因在關嶺牛不同發育時期中的表達

3 討論

肌球蛋白的分子結構變化是由于2個MHC 球形頭部的循環運動造成的，也使得其與ATP 得到了有效的融合，這使得肌動蛋白很難與頭部進行有效的融合，而此時，ATP的水解反應會產生強力的運動反應[8]。在對mRNA進行定量檢測的過程中，必須通過內參基因對目標基因進行表達量的確定[9]。通過此次試驗，關嶺牛的MYH3基因和MYH4基因表達最高的是30月齡的關嶺牛背最長肌，其次為18月齡的背最長肌，在胎兒背最長肌組織中表達量最低。MYH3基因和MYH4基因由胎兒到18月齡表達量有大幅度提升。Ennion 等[10]經過研究認為組織特異性與發育階段控制了MYH基因的表達；Olsvik 等[11]研究發現MYH基因在胚胎發育和組織樣品間均表達不穩定。綜上所述，MYH3基因和MYH4基因在出生后的動物肌肉組織中表達量相對較高，MYH3基因和MYH4基因隨著出生時間的推移呈上升趨勢，推測其表達水平與肌肉發育的程度有一定的關系，但具體的作用機制比較復雜，還需通過其他試驗進行驗證。

4 結論

本試驗發現，在出生后牛的肌肉組織中MYH3基因和MYH4基因具有較高的表達量，MYH3基因和MYH4基因隨著出生時間的推移表達量呈上升趨勢，本研究可為MYH3基因和MYH4基因功能的進一步研究奠定基礎。