38例HIV抗體陽性馬爾尼菲藍狀菌的分離鑒定體會

熊勁芝 張 林 袁紅霞

南華大學附屬郴州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心微生物室，湖南省郴州市 423000

馬爾尼菲藍狀菌(Talaromyces marneffei， TM)，原名馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei，PM)，是青霉菌屬中一種溫度依賴性雙相型條件致病性真菌，主要通過竹鼠傳播，流行于東南亞和我國南方地區(qū)[1]。艾滋病以及免疫力極其低下的患者常合并馬爾尼菲青霉感染。近年來感染PM患者也隨著 AIDS患者的增加而日益增多，重視并早期診斷意義重大。其在 25℃ 時呈菌絲相生長，產(chǎn)紅色素，37℃ 時呈酵母相生長，當人體感染PM后，PM以具有致病能力的酵母相寄生于宿主細胞內(nèi)。而分離培養(yǎng)出具有雙相型的TM是診斷馬爾尼菲藍狀菌病的金標準[2-3]。現(xiàn)對我院2010年6月—2017年12月收治的 38 例HIV抗體陽性的馬爾尼菲藍狀菌病患者的體液及組織雙相培養(yǎng)鑒定情況總結(jié)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組38例，均經(jīng)體液或組織真菌培養(yǎng)并鑒定為TM感染，其中血培養(yǎng)陽性33例，骨髓培養(yǎng)陽性5例。男性26例，女性12例，年齡24～76歲，平均年齡52.4歲。均為ELISA初篩試驗及 Western-blot 確認陽性的 HIV感染者。

1.2 培養(yǎng)鑒定方法 培養(yǎng)基為BACT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)儀配套的培養(yǎng)瓶(由法國生物梅里埃公司提供)，沙保羅瓊脂平板與血瓊脂平板培養(yǎng)基購自法國生物梅里埃公司。將患者血標本或骨髓標本注入血培養(yǎng)瓶，在BACT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)儀中孵育。陽性報警后，涂片染色鏡檢考慮為真菌后轉(zhuǎn)種兩塊沙氏培養(yǎng)基，分別置于25℃和37℃中培養(yǎng)，每24h后觀察1次菌落生長情況，分別取兩種環(huán)境下孵育的菌落進行涂片、固定、革蘭染色，并在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征。

2 結(jié)果

經(jīng)BACT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)儀增菌培養(yǎng)，均在5d內(nèi)出現(xiàn)陽性報警，其中24～48h報陽1株(2.6%)，48～72h報陽6株(15.8%)，72～96h報陽28株(73.7%)，96～120h報陽3株(7.9%)。接種于沙保羅培養(yǎng)基，分別于25℃和37℃中培養(yǎng)。結(jié)果：(1)25℃培養(yǎng)菌落呈霉菌相，生長迅速，2d左右可見灰白色絨毛狀霉菌樣菌落；1周左右菌落呈淡黃色絨狀，中央可見黃綠色，培養(yǎng)基呈玫瑰紅色，且隨培養(yǎng)時間延長而逐步加深并彌散至整個培養(yǎng)基。染色后鏡下可見菌絲細長分隔，大量帚狀枝，兩輪生多見，少數(shù)單輪生，分生孢子呈卵圓形或圓形，光滑，可見明顯孢間連體；(2)37℃ 培養(yǎng)菌落呈酵母相，生長緩慢，3～4d可見邊緣光滑整齊的圓形、灰白色乳酪樣菌落，無色素產(chǎn)生。2 周后菌落增大、干扁、周圍皺褶不齊。染色后鏡下可見大量類圓形長形酵母樣孢子，光滑，部分呈臘腸樣，有少量短菌絲。

3 討論

TM是青霉菌屬中唯一具有致病性的條件致病菌，1973年被Diaalvo等發(fā)現(xiàn)，多見于東南亞及我國廣西、廣東等南方地區(qū)，是一種易引起全身播散性損害的條件致病菌，多發(fā)生在免疫低下的人群中，在艾滋病人群中更常見，TM感染率高達18.6%，是東南亞地區(qū)艾滋病患者中僅次于結(jié)核分枝桿菌和新生隱球菌的第三大機會性致病菌[4]。

TM在培養(yǎng)過程中的不溶血、不渾濁、產(chǎn)酸量極少等特征，導致難以肉眼觀察確認菌落生長，而全自動血培養(yǎng)儀能根據(jù)培養(yǎng)中產(chǎn)氣量異常做出菌落生長的陽性報警提示，現(xiàn)通常采用全自動血培養(yǎng)儀進行培養(yǎng)。TM在血培養(yǎng)瓶生長較慢，自動血培養(yǎng)儀培養(yǎng)陽性報警峰值為4d(1.5～7d)[5]，本組TM陽性瓶報警73.7%在72～96h。建議對于遲緩報警的轉(zhuǎn)種后繼續(xù)室溫下靜置觀察上清液變化，若出現(xiàn)白色顆粒或棉絮狀物，涂片檢查更易找到TM特征菌，是確認TM簡單有效的方法，具有重要的臨床意義。

TM在體內(nèi)主要侵犯人體的單核巨噬細胞系統(tǒng)，包括骨髓、肝、脾、肺、淋巴組織及腸道淋巴結(jié)等，其感染后只有免疫力低下的少數(shù)人發(fā)病，臨床常表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、咳痰等呼吸道癥狀，納差、腹痛、腹瀉、肝脾及腹腔淋巴結(jié)腫大等消化道癥狀，以及皮膚臍窩樣壞死性丘疹、咽喉部潰瘍假膜等體征[6]。艾滋病合并TM感染時，骨髓培養(yǎng)陽性率最高，接近100%，其次為皮膚活檢(90%)和血培養(yǎng)(76%)，與TM首先在骨髓等單核巨噬細胞系統(tǒng)中大量繁殖，然后部分釋放到血液中這種生物特性有關(guān)，提示在早期診斷上，骨髓培養(yǎng)優(yōu)于血培養(yǎng)，可以避免部分因血培養(yǎng)陰性而漏診的患者[7]。HIV陽性者血培養(yǎng)TM陽性率76.7%， HIV陰性率47.1%，HIV 陽性患者較陰性患者TM感染后更容易出現(xiàn)發(fā)熱、脾臟增大、WBC下降、血小板降低、ALT 異常[8]。酵母相為致病相，在活體內(nèi)可逃避寄生宿主的免疫應(yīng)答，菌絲相到酵母相的轉(zhuǎn)變是TM發(fā)病機制的前提，HSP70基因是雙相轉(zhuǎn)化相關(guān)基因。機體抵抗TM入侵主要依靠細胞免疫，組織中出現(xiàn)的起主要作用的是 CD4+T細胞有助于殺滅真菌及使病變局限[9]。

因此，對于HIV陽性患者，出現(xiàn)不明原因發(fā)熱與肺部感染時，應(yīng)高度重視TM感染可能，及時對其進行血液或骨髓培養(yǎng)。從臨床標本分離培養(yǎng)出具有雙相型的TM仍是診斷馬爾尼菲藍狀菌病的金標準，但近2周的耗時及對檢驗人員經(jīng)驗技術(shù)的高要求所致的診治延遲是其不足之處[10]。