雙峰駝糞便中纖維素分解菌的篩選及酶學特性分析

何 靜 ， 李國偉，海 勒 ，吉日木圖,

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室,呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古駱駝研究院，內(nèi)蒙古阿拉善右旗 737300)

在自然界，纖維素是最豐富的可再生資源，通過對纖維素資源的充分利用，可以有效緩解環(huán)境污染、全球能源短缺以及動物飼料資源緊張等問題。目前，自然界中對結(jié)構(gòu)復雜的天然纖維素降解的有效途徑是生物降解，主要是借助真菌、細菌和放線菌產(chǎn)生的纖維素酶來進行降解；其中真菌的降解能力最強，木霉菌[1]和曲霉菌[2]產(chǎn)生和分泌的纖維素酶系最全面，效果也最佳。相較于真菌，細菌的降解能力較低，但是細菌具有培養(yǎng)簡單、生長速度快和發(fā)酵周期短等優(yōu)勢。因此，從自然界中篩選生長速度快、纖維素酶活性高、對培養(yǎng)條件和產(chǎn)酶條件要求適宜的纖維素分解細菌是一項關(guān)鍵科學問題[3-4]。

纖維素酶作為重要的酶制劑，已經(jīng)在人們生活的各個方面(畜牧業(yè)、食品、紡織、環(huán)保及化工等)得到廣泛應用。從環(huán)境中篩選高效降解木質(zhì)纖維素的菌株則成為重中之重的研究方向。目前研究人員已針對哺乳動物，如豬[5]、馬[6]、奶牛[7]、狗[8]和小鼠[9]等開展了不同區(qū)段胃腸道微生物多樣性的研究，以期能夠分離和鑒定出高效降低木質(zhì)纖維素的菌株。但是針對雙峰駝胃腸道微生物的研究十分有限。雙峰駝棲息于干旱的荒漠和半荒漠地區(qū)，喜食白沙蒿、鰭薊、沙蓬、梭梭、駝絨藜、白刺等植物。被譽為“沙漠之舟”的雙峰駝經(jīng)過長期的自然選擇，形成了獨特的生理功能，如解毒、耐饑渴、耐干旱、耐熱、耐寒等特性。雙峰駝的消化系統(tǒng)與其他反芻動物不同，雙峰駝僅有瘤胃、網(wǎng)胃、皺胃3個胃，沒有瓣胃[10]。先前的研究表明，與其他草食性動物相比較，飼料顆粒在駱駝胃內(nèi)的滯留時間會更長[11-12]。 近年來，駱駝腸道微生物的研究得到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。2013年，研究人員通過對單峰駝瘤胃微生物基于宏基因組焦磷酸測序，發(fā)現(xiàn)從門的水平上，擬桿菌門(Bacteroidetes，占55.5%)、厚壁菌門(Firmicutes，占22.7%)和變形桿菌門(Proteobacteria，9.2%)為主導菌群；分析瘤胃微生物潛在功能后發(fā)現(xiàn)，碳水化合物功能是單峰駝瘤胃微生物最豐富的功能類別，并且牛和駱駝具有相似的消化系統(tǒng)，單峰駝瘤胃中微生物的代謝功能與牛的極為相似[13]。2015年，Gharechahi 等[14]通過采集3峰成年雌性單峰駝的瘤胃內(nèi)容物，基于16S rRNA基因擴增測序探究單峰駝瘤胃中細菌群落的結(jié)構(gòu)特點，發(fā)現(xiàn)駱駝瘤胃微生物在結(jié)構(gòu)上與其他反芻動物相似，但在組成上不同。導致駱駝獨特瘤胃微生物組成的主要是其瘤胃中纖維素分解細菌的高度富集。2018年，Gharechahi等[15]對駱駝瘤胃內(nèi)容物進行全宏基因組測序，擬桿菌門含有較高的脫支酶和寡糖降解酶基因，厚壁菌門和纖維桿菌門含有豐富的纖維素酶和半纖維素基因，并且具有極高的多樣性。為了分離高效的駱駝源纖維素分解菌株，本研究采用羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)平板初篩法和搖瓶發(fā)酵復篩法，從雙峰駝糞便內(nèi)容物中分離篩選能夠高效降解纖維素的細菌，并通過生化指標、16S r RNA序列測定等方法對該菌株進行種屬鑒定，同時研究其所產(chǎn)纖維素酶的酶學特性，為開發(fā)雙峰駝源纖維素降解菌株提供菌種來源與試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市烏拉特后旗養(yǎng)殖廠，隨機采集10峰3歲成年健康雙峰駝(體質(zhì)量平均約為235 kg)的新鮮糞便，裝入 50 mL無菌無酶離心管中，放入于 4 ℃冰袋中帶回實驗室。

1.2 培養(yǎng)基

CMC-Na培養(yǎng)基[16]：CMC-Na 5.0 g，(NH4)2SO42 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，瓊脂粉 15.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2。

搖瓶發(fā)酵液體培養(yǎng)基[16]：普通 LB液體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分數(shù)為1.0%的 羧甲基纖維素(CMC)，用于纖維素分解菌的發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3 方 法

1.3.1 纖維素分解菌的篩選、分離和純化 稱量1 g樣品加入100 mL的富集培養(yǎng)基中，180 r/min、30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)3～4 d。取上述富集培養(yǎng)后的菌懸液稀釋10-3～10-6，再從各個稀釋樣品中取100 μL液體在CMC-Na固體培養(yǎng)基平板上涂布，于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2～ 3 d[17]。之后采用剛果紅染色法對菌株篩選，測量菌落直徑(測量結(jié)果用d表示)和透明圈直徑(測量結(jié)果用D表示)。根據(jù)透明圈直徑和菌落直徑的比值(D/d)大小進行菌株產(chǎn)纖維素酶能力的初步判斷，比值越大，則產(chǎn)酶能力越強，根據(jù)此原則從中選取產(chǎn)酶能力較強的菌株進行后續(xù)研究。挑出D/d比值大的菌落純化培養(yǎng)。純化后測定D/d比值較大菌株的纖維素酶活力，選取產(chǎn)纖維素酶活力強的菌株用于后續(xù)研究[18]。

1.3.2 CMCase酶活力的測定 將菌株接種到液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)3 d后離心取上清液，作為粗酶液。以葡萄糖作為標準，采用3,5-二硝基水楊酸(DNS) 試劑法測定纖維素酶活力，羧甲基纖維素酶(CMCase)和濾紙酶(FPase)活力以每毫升粗酶液每分鐘產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需酶量為1個酶活力單位(IU/mL)[16,18]。每組試驗做3次平行。

1.3.3 CMCase的酶學性質(zhì)研究 酶反應最適pH測定：將粗酶液置于pH 4、5、6、7、8和9的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中，50 ℃反應 30 min，取出發(fā)酵液體測定CMCase活性，每個樣品進行3個重復，確定CMCase反應的最適pH。

酶反應最適溫度的確定：將粗酶液分別置于不同溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃)發(fā)酵30 min，取出發(fā)酵液體測定CMCase活力，每個樣品設(shè)置3個重復，確定CMCase反應的最適溫度。

酶的熱穩(wěn)定性測定：將所制備的粗酶液分別在45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃和70 ℃水浴保溫10～60 min，取出發(fā)酵液體在最適溫度和pH下測定剩余酶活，每個樣品設(shè)置3個重復，評價該酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.4 菌株鑒定 形態(tài)學鑒定：利用光學顯微鏡，對菌株細胞的微觀結(jié)構(gòu)進行觀察，取培養(yǎng) 3～5 d 的分離菌菌液進行革蘭氏染色，確定細菌的革蘭氏屬性；并觀察菌落形狀、大小、顏色、透明度、光澤度、質(zhì)地、邊緣整齊程度、隆起度等。

生理生化鑒定：觀察菌落形態(tài)、透明度、顏色和邊緣等。根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》[19]中的方法測定分離菌株的生理生化特性。

分子生物學鑒定：提取分離菌株基因組DNA，采用細菌通用引物[20](27F:5′-AG- AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R:5′-GG-TTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增菌株的 16S rRNA 基因。PCR 擴增條件：95 ℃預變性 5 min；95 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共 24個循環(huán)；72 ℃ 修復延伸 10 min；4 ℃保存。獲得的PCR產(chǎn)物送至美吉生物有限公司進行測序，并進行同源性分析。將該序列提交至NCBI，序列號為MK396502。

1.3.5 分離菌株產(chǎn)酶條件研究 不同pH對菌株產(chǎn)酶活力的影響：改變初始pH分別為4.0、 5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，180 r/min震蕩培養(yǎng) 3～5 d后，取出液體檢測CMCase活力，每個樣品設(shè)置3個重復，確定菌株液體發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH。

不同溫度對菌株產(chǎn)酶活力的影響：在pH確定后，改變培養(yǎng)溫度，分別調(diào)至20 ℃、25 ℃、 30 ℃、35 ℃和40 ℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)3 d后，取出液體檢測CMCase活力，每個樣品設(shè)置3個重復，確定菌株液體發(fā)酵產(chǎn)酶的最適發(fā)酵溫度。

不同接種量對菌株產(chǎn)酶活力的影響：在pH和溫度確定的條件下，改變初始接種量，分別為1%、5%、10%、15%和20%，180 r/min震蕩培養(yǎng)3 d后，取出液體檢測CMCase活力，每個樣品設(shè)置3個重復，確定菌株液體發(fā)酵產(chǎn)酶的最適接 種量。

連續(xù)發(fā)酵對菌株產(chǎn)酶活力測定：將篩選出的降纖維素菌在液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行連續(xù)5 d的發(fā)酵培養(yǎng)，每個樣品設(shè)置3個重復，每天取出菌液，檢測CMCase酶活力，確定菌株液體發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵時間。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將獲得的DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析,選取同源性較高的模式菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析,借助MEGA 7.0軟件分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示，使用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計分析，用Excel 2016軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素分解菌的分離

為了能夠篩選出產(chǎn)纖維素酶活性較高的菌株，經(jīng)CMC-Na平板初篩，通過剛果紅染色從駱駝糞便內(nèi)容物中篩選出能夠降解纖維素的菌株。對透明圈較大的菌株進行純化，并檢測其纖維素酶活力(圖1)。AT9-6的CMCase酶活達 (0.48±0.03)IU/mL，F(xiàn)Pase為(0.21±0.06)IU/mL，相較于其他菌株，該菌株表現(xiàn)出更強的產(chǎn)纖維素酶的活力(表1)。

2.2 AT9-6菌株粗酶活性

2.2.1 酶反應最適pH及最適溫度 pH是影響酶催化效率的條件之一，而溫度是影響酶穩(wěn)定性的重要因素。按照酶活測定方法，計算相對酶活，確定不同pH和溫度對纖維素酶活力的影響。由圖2可知，CMCase反應最適pH為 6.0；當pH為5.0～9.0時，該菌株的酶活力比較穩(wěn)定，在pH較高時，該酶仍保持高活力的80%左右，表明該菌株產(chǎn)生的纖維素酶具有耐堿性。當反應溫度為50 ℃時相對酶活性最大。當溫度在40～60 ℃時，該酶的活力大于80%；當溫度大于70 ℃時，該酶的酶活迅速下降，表明該菌株產(chǎn)生的纖維素酶具有一定的耐熱性。

圖1 菌株AT9-6在CMC-Na平板上的透明圈Fig.1 Transparent circle of strain AT9-6 on CMC-Na plate

菌株StrainD/d值D/d value羥甲基纖維素酶活力/(IU/mL)CMCase activity濾紙酶活力/(IU/mL)FPase activityAT1-71.770.36±0.020.06±0.01AT3-31.320.26±0.010.1±0.02AT5-71.460.12±0.020.07±0.01AT6-41.840.41±0.040.14±0.3AT9-62.320.48±0.030.21±0.06

2.2.2 酶熱穩(wěn)定性 在45～70 ℃對提取的粗酶液分別處理10～60 min，計算相對酶活，判斷該酶的熱穩(wěn)定性。由圖3可知，在45 ℃時，分離菌纖維素酶的活性在處理60 min時仍可達85%以上。在50 ℃時，分離菌纖維素酶的穩(wěn)定性相對較好，水浴60 min后酶活力仍可達65%以上；在 55 ℃保溫20 min，該酶相對活性仍可保留在60%以上；當溫度達到65 ℃和70 ℃，處理 10 min時，其酶相對活力顯著下降，相對酶活力僅為40%左右。說明該菌株產(chǎn)生的纖維素酶在 45～50 ℃熱穩(wěn)定性較好。

圖2 不同pH(A)和溫度(B)下的酶活力Fig.2 Enzyme activity under different pH(A) and temperature(B)

圖3 菌株AT9-6 產(chǎn)CMCase的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermal stability of CMCase

2.3 分離菌株鑒定結(jié)果

2.3.1 菌株生理生化指標 通過對成年雙峰駝的糞便微生物進行篩選，最終得到1 株酶活較高的菌株AT9-6。將該菌株接種在CMC-Na培養(yǎng)基上，在37 ℃培養(yǎng)4 d，由圖4可知，該菌株菌落為圓形淡黃色，表面光滑，邊緣整齊，革蘭氏染色結(jié)果為陽性，菌體桿狀。由表2可知，該菌株能夠利用葡萄糖。氧化酶和接觸酶反應為陽性，可以利用明膠，能利用各種碳水化合物為碳源，并且能夠使硝酸鹽還原。根據(jù)菌株AT9-6的形態(tài)學特性及生理生化特性鑒定結(jié)果，初步確定該菌株屬于纖維單胞菌屬。

圖4 菌株AT9-6菌落形態(tài)及革蘭氏染色(10×100)Fig.4 Colony morphology and gram staining of the strain AT9-6

2.3.2 菌株分子生物學 測序結(jié)果顯示，該纖維素分解菌AT9-6的16S rRNA基因序列長度為1 255 bp左右。序列同源性分析顯示，菌株AT9-6與纖維單胞菌屬細菌的16S rRNA序列相似性達99%以上。系統(tǒng)進化樹分析顯示，該菌株與C.cellulansstrain親緣關(guān)系最近(圖5)。綜合該菌株的菌落形態(tài)、生理生化特性和分子生物學鑒定結(jié)果，確定獲得的纖維素分解菌AT9-6為纖維化纖維微菌。

表2 菌株AT9-6生理生化特性Table 2 Physiological-biochemical characteristic of AT9-6

注: + : 陽性; - : 陰性。

Note: +,Positive; -,Negative.

圖5 基于16S rRNA的纖維素分解菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic denfrogram of 16S rRNA gene sequence

2.4 菌株AT9-6產(chǎn)CMCase的初步優(yōu)化

2.4.1 不同pH對菌株AT9-6產(chǎn)CMCase的影響 不同菌株發(fā)酵培養(yǎng)要求的起始pH不同；初始pH過高或過低都會抑制菌株的生長，從而導致該菌株的產(chǎn)酶能力迅速下降。適當pH有利于菌株生長和菌株產(chǎn)酶；一旦pH過低或過高會直接抑制菌株生長，從而抑制酶的產(chǎn)生。本研究設(shè)置不同的起始pH，以確定pH對菌株AT9-6產(chǎn)CMCase的影響。結(jié)果如圖6所示，隨著pH的逐漸升高，其產(chǎn)酶活性也逐漸升高。在pH 4.0時，產(chǎn)酶活力最低，僅為0.37 IU/mL；在pH 6.0～8.0，該菌的產(chǎn)酶效果較好，在pH 7.0時產(chǎn)酶效果最好，酶活力可達0.54 IU/mL。當pH繼續(xù)增加時，該菌株的產(chǎn)酶能力逐漸下降。故最適AT9-6菌株產(chǎn)酶的最佳pH為7.0。

圖6 不同初始pH下AT9-6產(chǎn)酶的結(jié)果Fig.6 Result of different pH on cellulase production of AT9-6

2.4.2 不同溫度對菌株AT9-6產(chǎn)CMCase的影響 培養(yǎng)溫度直接影響菌株產(chǎn)酶的活力和酶的穩(wěn)定性。由圖7可知，隨著溫度的升高，菌株產(chǎn)酶活力先增大后降低。在20 ℃，酶活力最低，酶活僅為0.24 IU/mL；在30 ℃時，菌株發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶能力最強，酶活力可達0.62 IU/mL。說明培養(yǎng)溫度對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶存在一定的影響，較低溫度和較高溫度都不利于產(chǎn)酶。當溫度較低時，菌株生長緩慢，導致酶活力偏低。溫度過高可能會造成菌株的過早老化，酶分泌量減少。因此，初步確定在30 ℃條件下，CMC酶活最大。

圖7 不同溫度下AT9-6產(chǎn)酶的結(jié)果Fig.7 Result of different temperature on cellulase production of AT9-6

2.4.3 不同接種量對菌株AT9-6產(chǎn)CMCase的影響 在發(fā)酵過程中，適宜的接種量能夠使細菌發(fā)揮最佳的產(chǎn)酶能力。接種量的多少直接影響菌株的產(chǎn)酶能力，接種量過小會使細菌延遲進入對數(shù)期，使產(chǎn)酶的時間推遲；接種量過大會使細菌提前進入對數(shù)期，使產(chǎn)酶時間過早。如圖8所示，菌液的接種量會明顯影響酶活力。當接種量為10%時，CMC酶活力最高為0.66 IU/mL；當接種量增加到20%時，酶活顯著下降，達到最低 0.36 IU/mL。故最適AT9-6菌株產(chǎn)酶的最佳接種量為10%。

圖8 不同接種量下AT9-6產(chǎn)酶的結(jié)果Fig.8 Result of different inoculum volume on cellulase production of AT9-6

2.4.4 不同發(fā)酵時間對菌株AT9-6產(chǎn)CMCase的影響 在上述最佳的發(fā)酵條件下，對菌株AT9-6進行連續(xù)5 d的發(fā)酵產(chǎn)酶，每隔24 h取樣1次，測定CMCase活性。由圖9可知，該菌株在發(fā)酵24～72 h酶活性呈增長趨勢，在發(fā)酵培養(yǎng) 72 h時，產(chǎn)酶活性達到最強，可達0.66 IU/mL。隨著發(fā)酵培養(yǎng)時間延長，活力逐漸降低。分析原因可能是在72 h時該菌株適應發(fā)酵培養(yǎng)基后開始大量產(chǎn)纖維素酶；在96 h后，受培養(yǎng)基成分和菌株老化的影響，菌株產(chǎn)酶能力下降，酶活力僅有0.46 IU/mL。故最適AT9-6菌株產(chǎn)酶的發(fā)酵培養(yǎng)的時間為72 h。

圖9 發(fā)酵培養(yǎng)時間下AT9-6產(chǎn)酶的結(jié)果Fig.9 Result of different fermentation time on cellulase production of AT9-6

3 討論與結(jié)論

纖維素作為自然界中廣泛存在、含量最多的一種多糖，是微生物重要的碳源之一。纖維素是植物重要的組成部分，幾乎占總干質(zhì)量的50%[21]，通過對纖維素資源的充分利用，可以有效緩解污染、全球能源短缺等問題。但是，目前絕大部分的纖維素都不能被有效利用。據(jù)報道，有效分解纖維素不僅可以使自然界的纖維素資源轉(zhuǎn)化為所需要的能源，更能減少動物飼料中的粗纖維含量，促進動物的消化吸收[22]。目前降解纖維素的主要方法有微生物降解、化學降解、物理降解等[23]。大量的研究證實，生物降解纖維素是一種有效降解纖維的手段，該方法主要是利用纖維素分解菌及其所產(chǎn)生的酶來降解纖維素[24]。目前該方法被廣泛應用于不同草食性動物胃腸道內(nèi)容物的篩選中，如大熊貓[25]、藏豬[26]、牛[27]等。駱駝具有獨特的微生物特性，Gharechahi等[15]對駱駝瘤胃內(nèi)容物進行全宏基因組測序，確定了有助于木質(zhì)纖維素降解和發(fā)酵過程產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸的關(guān)鍵物種。但是從雙峰駝胃腸道中分離分解纖維素細菌的研究仍然鮮見。本研究以駱駝糞便為研究對象，分離篩選具有高效降解纖維的細菌。

研究證實，以CMC為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，基于剛果紅染色法初步分離篩選纖維素分解菌，簡單快捷、成本低，被認為是篩選纖維素分解菌最有效方法之一[28]。目前，已有許多研究人員從動物的胃腸道、糞便、土壤中分離出能夠降解纖維素的細菌，如芽孢桿菌屬[26]、瘤胃球菌屬[29]、擬桿菌屬[30]、假單胞桿屬[31]、梭菌屬[32]等。為了篩選駱駝源的纖維素分解菌株，本試驗采用 CMC-Na 平板初篩法和搖瓶發(fā)酵復篩法，從雙峰駝糞便內(nèi)容物中分離篩選能夠高效降解纖維素的細菌，并對其中1株透明圈較大的菌株進行純化后檢測其纖維素酶活力和菌株鑒定，初步鑒定該菌株為纖維化纖維微菌的一種，屬纖維單胞菌屬，放線菌門。

纖維單胞菌屬由纖維化纖維微細菌(C.cellulans),芬氏纖維微菌(C.funkei和C.terreum)3 個種組成。這些物種屬于需氧放線菌，表現(xiàn)為多形性革蘭氏陽性桿菌，自然存在于土壤、水和腐爛的木材中，也有部分菌株來自于海洋、昆蟲體表和人類腸道中[33]。此次篩選的菌株C.cellulans，屬纖維單胞菌屬，纖維單胞菌屬作為豐富糖苷酶的來源被人們廣泛關(guān)注。纖維微菌屬蘊含許多糖苷酶，如內(nèi)-β-1,4-葡聚糖酶、內(nèi)-β-1,4-木聚糖酶、內(nèi)-β-1,4-甘露聚糖酶和內(nèi)-β-1,3-葡聚糖酶。2012年，研究人員從云南紅豆杉的根土中分離出能分泌7-木糖紫杉烷糖基水解酶C.cellulansstrain F16[34]。能夠分泌纖維素酶的C.cellulans已從各種不同的環(huán)境中被分離篩選出來。此外，Wei等[35]研究報道，C.cellulansL804為一種木質(zhì)纖維素降解菌，可將未經(jīng)處理的玉米秸稈轉(zhuǎn)化為微生物絮凝劑，該菌株分泌纖維素分解酶活性的最佳pH為5.2～6.0。但從動物胃腸道中分離獲得C.cellulans的報道相對較少。本次研究獲得的菌株C.cellulans可以分泌纖維素酶，它在雙峰駝源纖維素降解菌株上具有一定的應用 潛力。

在微生物生長過程中，菌體的培養(yǎng)條件對其生長和代謝產(chǎn)物的積累都有重要影響。菌株的發(fā)酵條件，如碳源、氮源、溫度、pH和接種量等諸多因素對纖維素酶的產(chǎn)生具有顯著的影響。對于好氧性微生物，菌株的接種量會影響發(fā)酵培養(yǎng)基的溶氧量，溶氧量不足直接會影響菌株的繁殖和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[36]。此外，溫度、pH和發(fā)酵時間都會影響菌株產(chǎn)纖維素酶的活力。據(jù)報道，真菌纖維素酶一般為酸性酶，在pH 4～5、溫度40 ℃～60 ℃活性較高。細菌纖維素酶的最適pH通常在中性或偏堿性，其最適溫度為40 ℃～70 ℃。本次研究的纖維素酶最適溫度為40 ℃，最適pH為6，該結(jié)果與栗叢瑞[37]的研究結(jié)果相似。此外，研究證實纖維單胞菌最適生長溫度為20 ℃～ 37 ℃，最適pH為6.0～8.0[38]，本研究結(jié)果與報道一致。總之，本研究篩選并鑒定出一株纖維化纖維微菌，它具有相對較高的纖維素酶活。該菌株所產(chǎn)生的酶具有一定的耐堿性和耐熱性，因此可將該酶應用于食品行業(yè)或廢料處理等方面。

綜上所述，本研究從雙峰駝糞便樣本中分離到1 株纖維素分解菌。根據(jù)該菌的菌落形態(tài)、生理生化和分子生物學鑒定結(jié)果，確定該菌為C.cellulans。該菌株產(chǎn)纖維素酶的最適溫度為 40 ℃～50 ℃，最適pH為6.0。該菌株所產(chǎn)生的酶具有一定的耐堿性和耐熱性。初步確定該菌株液體發(fā)酵的最佳接種量為10%，最適初始pH為 7.0，最適培養(yǎng)溫度為30 ℃，最適發(fā)酵時間為 72 h。