五加皮丙酮提取物殺蟲活性的初步研究

2019-12-10 02:34:28李雪嬌

西北農業學報 2019年11期

張潔,李雪嬌

(1.咸陽職業技術學院儀祉農林學院，陜西咸陽 712000；2.西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心, 陜西楊凌 712100)

植物在與昆蟲長期共存和進化中產生許多次生代謝物[1-3]，這些物質可以對昆蟲的不同生長階段產生拒食、觸殺、抑制發育等作用[4-5]。植物源殺蟲劑就是從天然植物的不同組織中提取有效的活性成分，確定用量用法后，人為加工成可以防治植物蟲害的制劑[6]。植物源殺蟲劑具有不易產生藥害和抗藥性、作用方式多樣、對高等動物及天敵生物較為安全及原料易得等優點[7]，符合目前世界農藥的發展趨勢，其市場無疑是廣闊的[8]。西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心研究發現，多種植物的提取物都具有較高的殺蟲活性[9-10]，所以從植物中篩選開發天然的殺蟲劑是創制新型農藥的有效途徑之一[8,11]。

中國植物種類豐富多樣，具有優良的條件研究植物源殺蟲劑，據統計，目前中國現有高等植物約有3萬余種，其中包含470余科，3700余屬，居于世界第3位[12]。這其中有毒植物達到1300余種，而且大部分都具有殺蟲或抑菌活性[13]。因此，篩選具有殺蟲活性的植物對研發植物源殺蟲劑具有重要意義。

五加皮為五加科五加屬植物細柱五加(Acanthopanaxgracilistylus)的根皮，近年來研究發現五加皮具有抗炎鎮痛、抗應激、解熱、提高免疫力及抗腫瘤的效果[14-17],但目前少有研究五加皮的農用功效，也僅有其對棉紅蜘蛛及蚜蟲具有較好的觸殺活性的研究報道[18]，基于此，本試驗采用室內測定方法測定五加皮丙酮提取物對小菜蛾(PlutellaxylostellaL.)、粘蟲(MythimnaseparateW.)、蚜蟲(MyzuspersicaeS.)、酢漿草如葉螨(TetranychinahartiE.)、淡色庫蚊(Culexpipienspallens)、家蠅(MuscadomesticaL.)和玉米象(Sitophiluszeamais)7種害蟲的生物活性，并測定20%的五加皮乳油制劑對小菜蛾的田間藥效，為進一步研究五加皮的殺蟲生物活性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物樣品細柱五加于2018年5月采自秦嶺國家植物園。將其根皮置于室內通風處陰干， 45 ℃恒溫烘干，粉碎，過孔徑0. 355 mm篩，25 ℃密封，備用。

1.1.2 供試昆蟲小菜蛾(PlutellaxylostellaL.)于室內(飼養要求相對濕度70%±5%，溫度25±1 ℃，光暗周期12 L∶12 D，以下各試蟲飼養室內條件要求相同)用青菜葉飼養，取健康且大小一致的3齡幼蟲供試。

粘蟲(MythimnaseparateW.)為咸陽職業技術學院養蟲室飼養的品系。試驗時選取發育整齊一致且健康的成蟲供試。

玉米象(Sitophiluszeamais)為咸陽職業技術學院養蟲室飼養的品系。試驗時選擇發育一致且健康的成蟲。用消毒過的小麥(將小麥置于溫度為85 ℃烘箱內消毒1.5 h，將其含水量調整至 13%±2%喂養。

淡色庫蚊(Culexpipienspallens)和家蠅(MuscadomesticaL.)為引種自中國軍事科學院，試驗時選取羽化3 d，健康且未接觸過殺蟲劑的成蟲。

桃蚜(MyzuspersicaeS.)采于咸陽職業技術學院溫室大棚，試驗時選取健康活潑，大小一致的無翅成蚜。

酢漿草茹葉螨(TetranychinahartiE.)采于咸陽職業技術學院試驗基地，試驗時，選取健康活潑的害螨供試。

1.2 方法

1.2.1 五加皮的提取方法五加皮采用超聲波提取法提取[19]：按“1.1.1”方法將提取的五加皮細干粉加入丙酮(五加皮與丙酮比例為1∶10體積比)，每次35 min左右，重復3次。將提取物過濾，濾液在55±1 ℃內減壓、蒸餾后濃縮得丙酮總浸膏，置于4 ℃的冰箱內保存待用。

1.2.2 殺蟲活性的測定測定五加皮丙酮提取物對小菜蛾3齡幼蟲及粘蟲的拒食及毒殺活性使用小葉碟添加法[20]。將新鮮的且無病蟲害的甘藍葉用圓形打孔器(直徑1.0 cm)打成小葉碟，放于藥液中浸漬3 s取出，自然晾干后放入直徑為 9 cm的培養皿中，每個培養皿接入10頭饑餓 3～4 h的試蟲。每處理重復3次，每次重復10頭試蟲，并于處理后的24 h、48 h、72 h分別檢查、記錄結果，以丙酮處理為對照。以下式(1)計算試蟲死亡率。

校正死亡率=(處理組死亡率-對照組死亡率)/(1-對照組死亡率)×100%

(1)

粘蟲成蟲于處理后的24 h和48 h分別記錄其取食葉片數，以下式(2)計算拒食率。

拒食率=(對照取食葉碟數-處理取食葉碟數)/對照取食葉碟數×100%

(2)

計算試蟲拒食率采用葉片分級法[21]。參考分級標準為零級：葉片完整，未被試蟲取食；Ⅰ級：葉片上被取食有痕跡，但不明顯；Ⅱ級：葉片被試蟲取食缺刻明顯；Ⅲ級：葉片被試蟲取食超過 1/3；Ⅳ級：試蟲取食葉片超過1/2；Ⅴ級：試蟲將葉片取食僅剩殘渣。待試蟲取食完成后，記錄取食等級，以下式(3)和(4)計算小菜蛾及粘蟲的取食指數和拒食率。

每蟲取食指數=∑(為害級別×各級葉碟數)/(總葉碟數×最高為害級別×參試總數)

(3)

拒食率=(對照取食指數-處理取食指數)/對照取食指數×100%

(4)

采用浸蟲浸葉法[22]測定五加皮丙酮提取物對蚜蟲的毒殺活性。取一定量的丙酮提取物用吐溫-80水溶液稀釋到供試質量濃度(50 mg/mL、100 mg/mL)，將蚜蟲和供試葉片分別在藥液中浸漬5 s后取出，吸干多余藥液，放置于直徑為10 cm的培養皿(底部鋪濾紙)中，每處理重復3次，每次重復50頭試蟲，于藥液處理后的24 h、48 h、72 h分別檢查記錄結果，同時以吐溫-80水溶液作為空白對照(以下均以此為空白對照)，計算校正死亡率。

采用玻片浸漬法[22]測定五加皮丙酮提取物對酢醬草茹葉螨的毒殺活性。取一定量的丙酮提取物用吐溫-80水溶液稀釋到供試質量濃度(200 mg/mL、100 mg/mL)，將酢醬草茹葉螨放置于玻片上，將玻片在藥液中浸漬5 s后取出，置于吸水紙上迅速吸干多余藥液，每處理重復3次，每次重復50頭，于處理后的24 h、48 h、72 h分別檢查記錄結果，計算校正死亡率。

采用浸液法[20]測定五加皮丙酮提取物對淡色庫蚊的毒殺活性。取一定量的丙酮提取物用吐溫-80水溶液稀釋到供試質量濃度(1 mg/mL、 5 mg/mL、2.5 mg/mL)。每重復引入供試的淡色庫蚊20頭，每處理重復3次，于處理后的24 h、48 h、72 h分別檢查結果，計算校正死亡率。

采用點滴法[20]測定五加皮丙酮提取物對玉米象成蟲、家蠅成蟲的毒殺活性。用微量點滴儀將所需的不同質量濃度的藥液點滴于家蠅成蟲的前胸背板(每頭用量為0.125、0.25、0.5、1 mg)；玉米象成蟲的腹面(每頭用量為0.125、0.25、 0.5、1 mg)。每處理重復3次，每次重復30頭供試昆蟲，于處理后的24 h、48 h分別檢查結果，并以點滴同等量的丙酮作為空白對照，計算校正死亡率。

上述試蟲處理后均放于培養箱內培養觀察(相對濕度70%±5%，溫度25±1 ℃，光暗周期12 L∶12 D)。

1.2.3 田間藥效試驗配制20%的五加皮乳油用于田間藥效試驗，配方為20%五加皮丙酮提取物+70%丙酮+10%吐溫-80。使用時用清水分別稀釋200、400和600倍液噴施，以1.8%阿維菌素乳油稀釋4 500倍(有效成分質量濃度為 4 mg/L)作藥劑對照，以清水為空白對照，共5個處理，噴藥劑量為60 L/667m2，每處理重復4次，試驗共設20個小區，每小區面積為10 m2，隨機區組排列。于小菜蛾發生危害初期噴藥防治1次，用手動噴霧器噴霧，以葉片濕潤為度。每小區內連續選擇10株白菜苗分別于施藥前和施藥后定期、定株檢查活蟲數(不分蟲齡)，按下列公式計算防治效果。

防治效果=1-(對照區施藥前活蟲數×處理區施藥后活蟲數)/(對照區施藥后活蟲數×處理區施藥前活蟲數)×100%

(5)

1.3 試驗數據處理

采用SPSS 16.0軟件的機率值分析法求出AFC50、LC50及95%的置信限，采用Duncan’s新復極差法(P=0.05)進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 五加皮丙酮提取物對7種害蟲的拒食及觸殺活性測定結果

根據“1.2.2”中的測定方法測定五加皮丙酮提取物對7種害蟲的拒食活性及觸殺活性，結果見表1～表4。

表1 五加皮丙酮提取物對粘蟲和小菜蛾3齡幼蟲的拒食活性Table 1 Antifeedant of acetone extracts against from Acanthopanar gracilistylus of Mythimna separate W. and 3rd larva of Plutella xylostella L.

Note:If measured equationχ2is less than the value, the equation is in line with reality(The same as table 2).

表2 五加皮丙酮提取物對粘蟲及小菜蛾3齡幼蟲的觸殺活性Table 2 Poisoning activity of acetone extracts from A.gracilistylus against 3rd larva of Mythimna separate W. and P.xylostella L.

由表1可見，小菜蛾3齡幼蟲在藥劑處理 24 h和48 h時，拒食中濃度分別為9.89 mg/mL和4.32 mg/mL，證明五加皮丙酮提取物對小菜蛾具有較強的拒食活性。

從表2可見，粘蟲成蟲及小菜蛾3齡幼蟲的致死中濃度在72 h時低于48 h，表明藥劑對供試昆蟲的毒殺活性隨著時間的增加明顯升高；在處理48 h后，小菜蛾3齡幼蟲和粘蟲成蟲的致死中濃度分別為77.52 mg/mL、15.32 mg/mL，表明五加皮丙酮提取物對小菜蛾3齡幼蟲的觸殺活性高于粘蟲成蟲。

由表3可見，五加皮丙酮提取物在質量濃度為200 mg/mL ，24 h時對酢醬草茹葉螨的毒殺率為(61.71±1.32)%，觸殺活性較強，48 h、72 h時毒殺活性呈下降趨勢；對淡色庫蚊成蟲觸殺活性較強，而且隨著時間的延長和濃度的升高，死亡率增高，在質量濃度為5 mg/mL，時間為72 h時，淡色庫蚊的死亡率為(89.23±0.22)%。

由表4可見，五加皮丙酮提取物在每頭用量為1 mg，玉米象和家蠅48 h的死亡率分別為(18.17± 0.65)%和(10.02±1.32)%，證明五加皮丙酮提取物對玉米象成蟲和家蠅成蟲具有一定的觸殺活性，但效果不明顯。

2.2 大田藥效試驗結果

表5結果表明，20%的五加皮乳油的200倍和400倍稀釋液噴施后3 d防治效果分別為 70.23%和51.35%；7 d后防治效果分別達 65.42%和42.47%，其中200倍稀釋液與對照藥劑阿維菌素4 500倍稀釋液的藥效無顯著差異，對于防治白菜上的小菜蛾具有較好的效果；600倍的20%五加皮乳油防治小菜蛾效果不顯著(試驗期間未觀察到本試驗所用處理藥液對白菜的生長有不良影響)。

表3 五加皮丙酮提取物對蚜蟲、酢醬草茹葉螨和淡色庫蚊的觸殺活性Table 3 Toxic of acetone extracts from A.gracilistylus of T.hani,M.persicae and Culex pipiens pallens

注：“-”表示未有試驗結果，以下各表標注均同。表中數據為3次重復的“平均值± 標準差”(表4同)。

Note:“-” no test result，the same as following tables.Data represent “means ± standard deviation” of the 3 measurement in the table(The same as table 4).

表4 五加皮丙酮提取物對玉米象和家蠅成蟲的觸殺活性Table 4 Toxic of acetone extracts from A.gracilistylus against S.zeamais and M.domestica

表5 20%的五加皮乳油對白菜上小菜蛾的田間防治效果Table 5 The results of field trials of 20% A.gracilistylus EC against P.xylostella in cabbages

注：表中數值為4次重復的平均值。

Note:The data in the table are the average of 4 replicates.

3 討論

通過對五加皮丙酮提取物殺蟲活性研究發現，藥劑處理24 h和48 h時，小菜蛾3齡幼蟲的AFC50分別為9.89 mg/mL和4.32 mg/mL，在藥劑處理48 h后，小菜蛾3齡幼蟲的LC50為 77.51 mg/mL，證明五加皮丙酮提取物對其具有較強的拒食活性和觸殺活性；在藥劑處理24 h時對酢醬草茹葉螨的毒殺率為(61.71±1.32)%，在藥劑處理72 h時，淡色庫蚊的死亡率為(89.23±0.22)%，證明其對酢醬草茹葉螨害螨、淡色庫蚊成蟲均有較好的觸殺活性；田間藥效試驗結果表明，20%的五加皮乳油的200倍和400倍稀釋液噴施后3d防治效果分別為70.23%和51.35%；證明20%五加皮乳油200倍稀釋液對白菜上小菜蛾具有較強的防治效果。

近年來，由于化學類殺蟲劑的大量不理性使用，使得許多害蟲產生了抗藥性，如何在害蟲防治上降低其抗藥性成為研究的熱點[23-24]。五加皮屬天然植物，其丙酮提取物具有較好的拒食及觸殺活性，且低毒，易降解，不易產生抗藥性。五加皮在醫學中因其作用方式多樣，作用譜廣，越來越受到重視[25]，但目前其在農用功效方面研究較少，具有一定開發空間。