黑葉不結球白菜耐熱性的抗氧化指標評估體系的構建

趙思涵，田麗波，商 桑，楊 衍，鄒凱茜，曾麗萍，劉子記，劉昭華

(1.海南大學 園藝學院/海南省熱帶園藝作物品質調控重點實驗室，?？?570228；2.海南大學 生命科學與藥學院，海口 570228；3.中國熱帶農業科學院 熱帶作物品種資源研究所/農業部華南作物基因資源與種質創制重點開放實驗室，海南儋州 571737)

利用熱害指數進行耐熱性鑒定，過程復雜漫長，試驗過程中容易受到各種主觀、客觀因素影響，造成結果不夠準確。胡俏強等[7]對普通白菜進行37℃/27℃高溫處理，在前3d各品種間熱害指數差異不顯著，無法區分耐熱品種，到第7天可區分部分熱敏與耐熱品種，對普通白菜只進行高溫處理耐熱性強弱難以區分。植物的耐熱性是多基因控制的數量性狀，高溫脅迫下會涉及多個生理生化變化，可引起植物膜脂過氧化作用，導致植物細胞破壞或細胞死亡，植物內源保護系統的抗氧化能力及生物膜的穩定性對植物逆境脅迫響應至關重要[8]。采用單一指標，不足以反映出植物的耐熱性差異，根據植物對熱脅迫的抗氧化指標的響應結合多元統計分析可對植物耐熱性進行全面準確的評價。

近年來，已有多篇文章利用多元統計分析法對植物生物脅迫和非生物脅迫抗性進行綜合評價，該方法已得到廣泛應用，如在黃瓜[8]、萬壽菊[9]、大豆[10]、棉花[11]等植物抗逆性鑒定表現優良。本試驗以13個黑葉不結球白菜品種為試材，測定37℃/27℃高溫脅迫下黑葉不結球白菜的12個抗氧化指標，運用多元統計方法，分析各影響因素的作用及相互之間的關系，構建黑葉不結球白菜耐熱性抗氧化指標評估體系，對黑葉不結球白菜主要栽培品種的耐熱性強弱進行分類，使黑葉不結球白菜耐熱性鑒定直觀、簡便和準確，為耐熱黑葉不結球白菜品種選育、鑒定耐熱品種的遺傳多樣性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試黑葉不結球白菜品種13份購于各種子公司，見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 培育幼苗及溫度處理 選取飽滿、整齊一致的種子，溫湯浸種，20 ℃下催芽，60%露白時播種于50孔育苗穴盤，一穴一粒。兩片子葉展開后移栽至8 cm×10 cm黑色育苗缽?；|配方是體積比1∶1∶1的泥炭、蛭石和珍珠巖，常規管理。當幼苗長至4～5片真葉時，在人工氣候箱中預處理2 d，溫度為25 ℃/18 ℃，光強為300 μmol /(m2·s)、光周期為晝夜12 h /12 h，相對濕度控制在70%～80%。然后進行高溫脅迫 37 ℃/27 ℃處理，高溫處理5 d，對照處理為 25 ℃/18 ℃，其余條件同上。每個處理3次重復，每次重復18株，隨機區組排列。處理5 d后，測定各項形態及抗氧化指標。

表1 供試的黑葉不結球白菜品種Table 1 Non-heading Chinese cabbage varieties tested

1.2.2 測定項目及方法 熱害指數(Heat injury index,HII)的測定參考2014江蘇省耐熱小白菜鑒定實施標準[4]、劉維信等[6]和胡俏強等[7]的方法，略有改動，每天進行觀察，根據葉片反卷及褪綠，確定分級標準。熱害指數小則材料耐熱性強。

熱害指數=∑(各級株數×級數)/(最高級 數×調查總株數)×100%

1.2.3 數據統計分析 除熱害指數外，對其他12個指標計算耐熱系數。用 SAS 9.2 軟件對所有指標進行多元線性相關性分析、多元逐步線性回歸分析、隸屬函數分析、主成分分析和多元聚類分析。隸屬函數分析依照模糊數學中隸屬函數的方法[12]。用 Excel 2010軟件對所得數據進行 整理。

本文探討了環偶極子超材料的研究和發展現狀，環偶極子獨特電磁特性能與太赫茲波特性相結合，必產生一系列獨特的物理現象。太赫茲頻段環偶極子超材料可以緩解太赫茲波段器件缺少的現象，可實現對太赫茲波進行調控、濾波、開關和延時等操控，可用于制備傳感器、調節器、切倫科夫計數器等太赫茲先進器件。

耐熱系數=處理測定值/對照測定值

各綜合指標隸屬函數值：μ(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)j=1,2,…,n

各綜合指標的權重：Wj=Pj/∑Pjj=1,2,…,n

綜合耐熱評價：D=∑[μ(Xj)×Wj]j=1,2,…,n

式中，Xj表示第j個綜合指標；Xmin表示第j個綜合指標的最小值；Xmax表示第j個綜合指標的最大值。Wj表示第j個綜合指標在所有指標中的重要程度即權重；Pj為各自交系第j個綜合指標的貢獻率。D值表示各高代自交系在高溫脅迫下由綜合指標評價所得的耐熱性綜合評價值。對D值進行聚類分析，并對D值與耐熱系數進行逐步回歸分析。

2 結果與分析

2.1 黑葉不結球白菜各指標的方差分析和相關性分析

由表2可知，黑葉不結球白菜品種經高溫處理后，其APX、GR、MDA、ASA、PAL、PPO、POD、SOD、CAT的耐熱系數平均值均大于1，說明高溫脅迫對上述9個指標均呈正向效應。除APX、POD外其余指標均表現出顯著差異(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01)，說明本試驗中的黑葉不結球白菜品種在耐熱性上具有很好的遺傳多樣性，這11個指標都可以作為黑葉不結球白菜耐熱性評價的輔助指標。

表2 高溫脅迫下13個黑葉不結球白菜品種耐熱系數及各指標多元方差分析Table 2 Heat resistance coefficient of 13 black leaf non-heading Chinese cabbage varieties under high temperature stress and various indexes of multivariate analysis of variance

注：*、**代表不同品種的某個性狀在0.05或0.01水平具有顯著性差異,下表同。

Note: *,** represents significant difference of certain trait at 0.05 or 0.01 level,the same below.

對各品種的13項指標進行相關分析得出相關系數矩陣。從表3可以看出，13個品種的部分生理指標之間存在不同程度相關性，使得各指標間提供的信息存在著明顯的重疊。其中GSH與AsA呈極顯著正相關，GSH、AsA與MDA和GR呈顯著正相關，AsA、PAL與PPO呈顯著負相關，APX與H2O2和 呈顯著負相關， 與H2O2呈顯著正相關， 與CAT呈顯著正相關，PAL與POD呈極顯著負相關，與PPO呈顯著負相關，H2O2、SOD與熱害指數呈顯著負相關，說明在高溫脅迫下，黑葉不結球白菜的各抗氧化指標之間存在一定的協同性和拮抗性，抗氧化酶和抗氧化物質協同清除 ，避免H2O2的過量積累，從而減少高溫脅迫對膜系統的傷害。不同指標在熱脅迫下反應不同，說明不結球白菜的耐熱性較為復雜，單項指標難以準確客觀地反映不結球白菜品種對高溫的耐熱性差異，因此，構建復合指標評估體系，采用多元統計分析方法對各指標進行綜合評價以彌補單項指標鑒定的局限性是非常有必 要的。

表3 黑葉不結球白菜各指標間的相關系數矩陣Table 3 Correlation coefficient matrix of different indexes about black leaf non-heading Chinese cabbage

注：*、**代表各指標在0.05或0.01水平上的相關性。

Note: *,** represents significant correlate at 0.05 and 0.01 level.

2.2 主成分分析

通過計算各抗氧化指標的耐熱系數與主因子系數，得到每個品種的4個主因子得分值。說明該品種在這一主因子上的耐熱性強則CI值大，反之耐熱性弱。由表5可以看出，B12和B1在主因子1上的耐熱性最強，B8主因子2 上的耐熱性最強，B20在主子3上的耐熱性最強，B21在主因子4上的耐熱性最強。

2.3 隸屬函數分析

利用主因子貢獻率計算各主因子的權重(Wj)。由表6可以看出，主因子1的權重最大。在黑葉不結球白菜耐熱性評價中4個主因子的作用不同，將CI(j)值利用隸屬函數法進行轉換，得到各品種的隸屬函數值μ(j)和綜合評價值(D)，根據D值評價各品種的耐熱性。13個黑葉不結球白菜品種的耐熱性強弱依次為:B12>B14>B19>B1>B16>B2>B21>B18>B8>B10> B9>B20>B15。

2.4 聚類分析

采用系統聚類(Hierarchical clustering ) 中的最長距離法(Furthest neighbor) ，以歐氏距離(Euclidean distance) 為遺傳距離進行聚類分析，結果見圖 1，在歐式距離為0.73時，可劃分為4類。第Ⅰ類(強耐熱品種)包括3個品種，B12、B14、和B19，第Ⅱ類(耐熱品種)包括3個品種，B16、B2和B1，第Ⅲ類(不耐熱品種)包括4個品種，B21、B18、B8和B10，第Ⅳ類(熱敏感品種)包括3個品種，B9、B20和B15。

表4 各綜合指標的系數及貢獻率Table 4 Coefficients of comprehensive indexes and proportion

表5 13個黑葉不結球白菜的4個主因子得分值Table 5 Scores of main four factors of black leaf non-heading Chinese cabbage

2.5 綜合評價及分類

分析13個參評性狀與不同品種之間的耐熱性關系，篩選能夠客觀鑒定黑葉不結球白菜耐熱性的指標，建立數學模型用于黑葉不結球白菜種質耐熱性評價，將耐熱性綜合評價值(D值) 作為因變量，各單項指標的耐熱性數據作為自變量進行逐步回歸分析，建立最優回歸方程D= 0.019 76+0.623 98AsA+0.152 92H2O2- 0.142 79SOD-0.214 34PPO，方程決定系數R2=0.925 4，P< 0.000 1。由此方程可知，13個參評性狀中有4個性狀對黑葉不結球白菜耐熱性的鑒定有顯著性影響，分別是抗壞血酸過氧化物酶活性、過氧化氫、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶。

3 討論與結論

植物耐熱性受多種因素影響，需要綜合多項指標分析各品種間的耐熱性。多元統計方法將高維問題轉換成低維問題加以處理，使定量評價、鑒定變得相對簡單、直觀，并通過有效分類方法將評價對象定性劃分成不同類別[14]。其中主成分分析方法解決了綜合變量覆蓋和降維問題，將多個指標轉化為綜合指標，仍然可以盡量反映原來變量的信息量。本試驗采用多元統計分析方法包括方差分析、相關性分析、主成分分析、聚類分析實現了數據對象集合的聚類歸約，使結果更為科學合理[5,12]。

在高溫脅迫條件下，植物受到傷害主要是細胞產生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)導致生物膜過氧化作用[15-18]。植物細胞內保護酶(SOD、POD、CAT、APX)和抗氧化物質(AsA、GSH)在高溫下形成植物酶促防御系統，整體含量先增加后降低，個別指標表現為持續性連續下降的變化[18-22]。PPO作為內源呼吸酶在植物氧化酶系中，與植物的代謝強度及環境脅迫密切相關。葉陳亮等[23]對大白菜的研究表明，耐熱性強的品種SOD活性高于耐熱性弱的品種。在高溫脅迫過程中誘發植物細胞內以H2O2為代表的活性氧水平的增加而導致氧化脅迫[22-25]。在本試驗中SOD與熱害指數呈顯著負相關， 與H2O2呈顯著正相關與在大白菜上的研究結果相似。作為植物抗氧化劑的AsA，可直接清除羥基自由基、超氧自由基，通過 AsA-GSH循環，精密調控植物細胞中的 H2O2等，AsA-GSH循環控制在細胞可行使信號傳導的和逆境脅迫應答及適應的生理水平[26-29]，本試驗中GSH與AsA呈極顯著正相關，GSH、AsA與MDA和GR呈顯著正相關。本試驗研究結果表明，高溫脅迫下黑葉不結球白菜MDA 含量增加，說明高溫脅迫使黑葉不結球白菜細胞膜脂過氧化作用增強，SOD、POD活性呈升高的變化趨勢，AsA含量總體也呈上升趨勢，說明高溫脅迫下黑葉不結球白菜可通過提高SOD和POD酶的活性來清除自由基，起到一定的抗氧化保護作用，ASA可增強黑葉不結球白菜的抗氧化脅迫能力，它們構成了黑葉不結球白菜適應高溫逆境的重要物質基礎。即SOD、POD、PPO和H2O2與黑葉不結球白菜的耐熱性有一定的關系[30-32]。

表6 13個品種隸屬函數μ(j)值和耐熱排名Table 6 Value of membership function μ(j) of 13 varieties and ranking of heat-tolerance

圖1 13份黑葉不結球白菜種質耐熱性的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of heat tolerance of 13 black cabbage non-heading Chinese cabbage

研究高溫脅迫下植物抗氧化指標的響應，挖掘與耐熱性相關的鑒定指標，構建黑葉不結球白菜耐熱性抗氧化指標評估體系，對黑葉不結球白菜耐熱性品種選育和為生產推薦優良品種具有重要意義。本研究通過多元統計分析，最終發現編號為B12的“中腳葵扇黑葉匙羹白”、編號為B14的“玉兔雜交黑葉白菜”和編號為B19的“北京黑葉白”，在13個黑葉不結球白菜品種中的耐熱性最好，綜合性狀表現較優，與田間觀察結果基本一致，但在各品種的耐熱排序上不完全相同，所以采用多元分析方法綜合鑒定，避免淘汰耐熱優良 品種。