增齡對大鼠心肌缺血再灌注后TLR-4的影響

林運靈

[摘要] 目的 探討增齡對大鼠心肌缺血再灌注后TLR-4及相關炎癥因子的影響。方法 選取該院于2018年1—6月間實驗室以青年（3月齡）及老年（18月齡）清潔級健康雄性SD大鼠建立心肌缺血再灌注模型，依據鼠齡分為：①假手術青年組（Sham-Y組）及假手術老年組（Sham-A）;②心肌缺血再灌注青年組（IR-Y組）及心肌缺血再灌注老年組（IR-A組）。檢測大鼠心肌梗死面積、炎癥因子變化，蛋白電泳分析TLR-4表達的變化。結果 與Sham-Y組相比， Sham-A組TNF-α（30.1±5.3）ng/mL、IL-6水平（34.2±3.7）pg/mL顯著增高（P<0.05）;缺血再灌注后，與IR-Y組相比，IR-A組心肌梗死面積顯著增大;與IR-Y組相比，IR-A組血清TNF-α（421.2±56.9）ng/mL、IL-6水平（129.3±11.5）pg/mL顯著增高（P<0.05），血清IL-10水平（48.2±4.1）pg/mL顯著減低（P<0.05）;與IR-Y組相比，IR-A組TLR-4表達顯著增強，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 增齡導致心肌缺血再灌注后心肌TLR-4及其相關炎癥因子表達增強。

[關鍵詞] 心肌缺血再灌注損傷;Toll樣受體;炎癥

[中圖分類號] R54? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2019）09（c）-0008-03

[Abstract] Objective To observe the effects of aging on TLR-4 and related inflammatory factors after myocardial ischemia-reperfusion in rats. Methods The model was established in the laboratory from January to June 2018. The model of myocardial ischemia-reperfusion was established in young （3 months old） and old （18 months old） clean-grade healthy male SD rats， 1.sham-operated group （Sham-Y group） and sham-operated group （Sham-A）; 2.myocardial ischemia-reperfusion group （IR-Y group） and myocardial ischemia-reperfusion group （IR-A group）. The myocardial infarct size and inflammatory factors were detected in rats， and the expression of TLR-4 was analyzed by protein electrophoresis. Results Compared with Sham-Y group， TNF-α （30.1±5.3）ng/mL and IL-6 level（34.2±3.7）pg/mL were significantly increased in Sham-A group （P<0.05）. After ischemia-reperfusion， compared with the IR-Y group， the area of myocardial infarction in the IR-A group was significantly increased; compared with the IR-Y group， the serum TNF-α（421.2±56.9） ng/mL and IL-6 levels in the IR-A group （129.3±11.5）pg/mL was significantly increased （P<0.05）， serum IL-10 level （48.2±4.1） pg/mL was significantly decreased （P<0.05）; IR-A group TLR-4 expression was significantly enhanced compared with IR-Y group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Age-induced myocardial TLR-4 and its related inflammatory factors are enhanced after myocardial ischemia and reperfusion.

[Key words] Myocardial ischemia-reperfusion injury; Toll-like receptor; Inflammation

心血管病仍然是人口首位死亡原因[1]，受老齡化的影響，心血管病患病及死亡的絕對人數仍在持續上升[2]，給社會及家庭帶來沉重的負擔。與青年人相比，老年人心血管病預后更差。動物實驗結果顯示，與青年小鼠相比，老齡小鼠在心肌梗死后梗死區域擴展更為嚴重，心功能更差[3];諸多有效的干預措施如缺血后處理等在老年動物心臟也喪失其保護作用[4]。老年心臟對損傷的易感性的機制仍未得到闡明。

心梗后炎癥反應為心臟修復所必需，TLR（Toll-like receptor，TLR）介導的內源性免疫反應是心肌缺血再灌注后炎癥反應的重要組成部分。動物試驗結果顯示，抑制Toll樣受體-4（TLR-4）的表達能夠顯著減輕梗死心肌炎癥反應，減輕心肌損傷[5]。目前尚不清楚，衰老對心肌缺血再灌注后TLR-4及其相關炎癥通路信號分子表達是否有影響。

該研究選取2018年1—6月間該院實驗室參與實驗的小鼠為研究對象，旨在通過對3月齡及18月齡大鼠建立心肌缺血再灌注模型，觀察衰老對心臟TLR-4及其下游炎癥信號分子的變化，探討TLR-4在衰老大鼠心肌缺血后的作用及其可能機制，現報道如下。

1? 材料

1.1? 實驗動物及分組

2月齡清潔級健康雄性Sprague-Dawley大鼠（180～200 g），自由飲食，動物飼養及動物實驗方案遵循國家《實驗動物管理條例》。待各組實驗動物分別飼養至3月齡、18月齡，分別進入假手術及心肌缺血再灌注組。該研究分組：①假手術組（Sham組）：只穿線不結扎，根據實驗動物月齡再分為青年組（Sham-Y組）及老年組（Sham-A組）;②心肌缺血再灌注組（IR組）：根據實驗動物月齡再分為青年組（IR-Y組）及老年組（IR-A組），每組動物8只。研究步驟詳見動物模型建立部分。

1.2? 試劑、儀器

氯化三苯基四氮唑（TTC）：美國Amresco 公司;伊文氏藍：Sigma公司;美國RD公司TNF-α、IL-6、IL-10? ELISA試劑盒分別購于USCN及R&D公司; TLR-4 多克隆抗體及MyD88多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。其余試劑為市售分析純產品。BL-420E生物機能實驗系統：成都泰盟科技有限公司;小動物呼吸機（TKR-200C）：江蘇特力麻醉呼吸設備公司; Mini Trans-Bloe電泳儀（Bio.Rad公司，美國），全自動凝膠圖象分析儀（Syngene公司，美國）， Image.Pro Plus圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。

2? 動物模型建立及指標檢測

2.1? 大鼠心肌缺血再灌注模型制備

缺血再灌注組以穿線結扎法結扎左冠脈建立大鼠缺血-再灌注模型[6]。缺血30 min后，松開絲線恢復血流，缺血心肌顏色從暗紅變為鮮紅，心電圖顯示抬高的ST段下降1/2，說明再灌注成功，逐層關胸。在大鼠出現吞咽動作后，拔除氣管導管，放入籠中，繼續保溫，蘇醒后自由飲水進食。假手術對照組動物模型復制方法同上，但只穿線但不收緊線。

2.2? 檢測指標與檢測方法

2.2.1? 心梗面積測定? 心肌缺血區和心肌梗死范圍的測定按照既往方案進行，計算梗死區（ infarct size， IS）心肌與危險區（area at risk，AAR）心肌重量的比值IS/AAR，用以表示心肌梗死范圍的大小。心肌缺血區范圍用心肌缺血區重量占左心室重量百分比（AAR/LV）表示。心肌梗死范圍用心肌梗死區重量占心肌缺血區重量百分比（IS/AAR）表示。

2.2.2? 血清TNF-α、IL-6、IL-10含量檢測? 處死前取靜脈血1 mL，放入含乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）的EP管中，混勻后1 400×g離心15 min，取血漿-20℃保存。待標本收集齊后，于4℃冰箱自然解凍，按ELISA試劑盒說明書檢測血清TNF-α、IL-6、IL-10的濃度。

2.2.3? Westernblot檢測心肌TLR-4、MyD88表達? 于再灌注7 d處死動物，取保存的心肌組織加入適當液氮研磨后，加入細胞裂解液，充分作用后于100℃加熱，12 000 g/min離心10 min，取上清液，測定蛋白濃度（根據樣品濃度調整上樣蛋白量為50 μg/孔），經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移至硝酸纖維素濾膜上，脫脂奶粉封閉，加入1： 1000稀釋的一抗，4℃過夜，用辣根過氧化物酶標記的二抗檢測目標蛋白。ECL化學發光試劑顯色，X線膠片壓片，顯影、定影，圖像分析系統測定目的條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH條帶的吸光面積積分比值來評定其蛋白表達水平。

3? 統計方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據統計學分析。計量資料以（x±s）表示，用t檢驗，計數資料以[n（%）]表示，用χ2檢驗。對各組數據進行方差齊性檢驗（Levene檢驗）及正態性檢驗（F檢驗）。符合正態分布組間比較采用One-Way ANOVA分析，組間兩兩比較，方差齊者采用SNK-q檢驗，方差不齊采用Game-Howell檢驗;但若數據屬于非正態分布，則采用Kruskal-wallis H檢驗;P<0.05為差異有統計學意義。

4? 結果

4.1? 各組心肌缺血與心肌梗死面積比較

青年組及老年組心肌缺血面積之間[（45.0±3.2）% vs （47.8±4.2）%]差異無統計學意義（t=0.16，P>0.05）。在心肌缺血再灌注后，與青年組（IR-Y組）相比，老年組（IR-A組）心肌梗死面積顯著增大（42.8±3.4）% vs （55.4±5.1）%，差異有統計學意義（t=16.368， P<0.05）。

4.2? 各組血清TNF-α、IL-6、IL-10含量比較

與假手術組相比，心肌缺血再灌注后，心肌再灌注組血清炎癥因子含量明顯增高。與Sham-Y組相比，Sham-A組血清TNF-α及IL-6水平顯著增高，差異有統計學意義（P<0.05）。如表1所示，與IR-Y組相比，IR-A組血清TNF-α及IL-6水平顯著增高，差異有統計學意義（P<0.05）;IR-A組IL-10水平顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。

4.3? 各組心肌TLR-4、MyD88含量比較

如圖1所示，與假手術組相比，心肌缺血再灌注組大鼠心肌TLR-4、MyD88表達顯著增強，差異有統計學意義（P<0.05）;與Sham-Y組相比，Sham-A組心肌TLR-4、MyD88水平顯著增高，差異有統計學意義（P<0.05）與IR-Y組相比，IR-A組TLR-4、MyD88表達顯著增強，差異有統計學意義（P<0.05）。