基于ChinaPca全基因組數據和基因表達量探討LRP1對前列腺癌發病的影響

熊瀚 林睿 唐韋竹 蒙清貴 張慶云 陳陽 程繼文

作者單位：530021 南寧 1廣西醫科大學附屬腫瘤醫院泌尿外科；2廣西醫科大學研究生院；3廣西醫科大學基因組與個體化醫學研究中心；4廣西醫科大學第一附屬醫院泌尿外科

前列腺癌（prostate cancer，Pca）是男性泌尿系統常見的惡性腫瘤，發病率在男性惡性腫瘤中居第1位，死亡率居第5位［1］。我國前列腺癌發病率較低，但呈逐年上升趨勢，目前發病率位居男性泌尿生殖系統惡性腫瘤第1位［2］。前列腺癌發病的危險因素有年齡、種族和遺傳等［3］。前列腺癌發病風險亦與SNP有關，迄今通過全基因組關聯分析（genomewide association study，GWAS）發現與前列腺癌發病相關的SNP數量達170余個，其中多數為歐美人群的研究結果［4］。中國人群的GWAS研究發現rs817826位點和rs103294位點與前列腺癌發病有關［5］。

低密度脂蛋白受體相關蛋白-1（low density lipoprotein receptor-related protein-1，LRP1） 有內吞細胞外蛋白酶和信號傳遞作用，參與脂蛋白代謝、細胞代謝和運動等多種生物過程［6］。研究發現LRP1可通過誘導基質金屬蛋白酶-2（matrix metallopeptidase 2，MMP2）和MMP9表達，促進癌細胞遷移和侵襲［7］。前列腺癌組織中亦發現LRP1基因突變重排［8］。本課題組前期研究［9］發現LRP1基因在前列腺癌組織中突變率為23.1%。本研究進一步從LRP1基因的SNP及其表達量探討LRP1基因對前列腺癌發生的影響。

1 材料與方法

1.1 LRP1基因SNP信息

本研究共納入9個與LRP1基因有關的SNP，包括本研究前期在26例前列腺癌患者全外顯子基因測序中的致病SNP 2個［9］，以及在GWAS Catlog網站（https：//www.ebi.ac.uk/gwas/）搜集LRP1基因在不同關聯研究中差異有統計學意義的SNP 7個（P＜5×10-8）。SNP基本信息見表1。

表1 LRP1基因SNP的基本信息Tab.1 Basic information of LRP1 gene SNP

1.2 SNPs的選擇

中國前列腺癌遺傳學協會（Chinese consortium for prostate cancer genetics，ChinaPca）對來自中國東部和南部9所醫院或大學的前列腺癌患者進行全基因組關聯研究。病例組為確診的前列腺癌患者；對照組為未患前列腺癌且前列腺特異性抗原（PSA）＜4 ng/mL，直腸指檢陰性，一級親屬未患前列腺癌的社區人群。兩組研究對象均抽取靜脈血液進行DNA樣本測序。采用IlluminaHumanOmniExpress微珠芯片對病例組1497例患者和對照組1 008名志愿者的731 458個SNP進行基因分型。采用標準的質量控制程序選擇樣本并分析SNPs：若樣本總體基因分型百分比＜95%，性別不明，重復樣本或樣本間有家族關系，則排除該樣本；若SNP檢出率＜95%，最小等位基因頻率（MAF）＜0.05或對照組間的哈迪-溫伯格平衡試驗P＜0.001，則排除該SNP。經質量控制分析，病例組納入1417例，對照組1 008名，共587 292個SNP。ChinaPca數據的詳細描述見文獻［5］，本研究數據來自上述質量控制后的測序數據。

1.3 免疫組化法檢測LRP1在Pca組織中的表達

1.3.1 標本來源 收集廣西醫科大學第一附屬醫院2015年至2016年腹腔鏡下前列腺癌根治術后有完整臨床病理資料的12例前列腺癌組織標本（前列腺癌組），癌旁正常組織（距離癌組織≥3 cm）18例（癌旁正常組），以及在B超引導下經直腸或會陰前列腺穿刺術的前列腺炎組織4例（前列腺炎組）。癌旁正常組患者平均年齡64.4歲（46～78歲），前列腺癌組64.9歲（46～78歲），前列腺炎組68歲（49～80歲）。本研究經廣西醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準（審批號：20160304-12），患者簽署知情同意書。

1.3.2 免疫組化檢測 前列腺組織經10%中性福爾馬林固定，常規脫水、石蠟包埋，4 μm厚切片，分別滴加一抗兔抗人單克隆抗體LRP1（購自英國abcam公司）和DAB顯色劑進行 DAB染色，置于顯微鏡下觀察。LRP1陽性著色部位主要位于細胞膜和細胞質，部分細胞核染色。計數被染色細胞，于200倍顯微鏡下觀察免疫組化染色。染色陽性細胞數占0～10%，計0分；占 11%～25%，計 1分；占 26%～50%，計 2分；占51%及以上，計3分。染色強度評定：細胞完全無著色計0分，淺黃色計1分，黃色計2分，深棕黃色計3分。免疫組織化學結果總分為染色陽性細胞率計分和染色強度計分的乘積，其中總分≤1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），3～6分為中等強度陽性（++），7～9分為強陽性（+++）。由2名病理醫師鏡下閱片，復核診斷及進行組織病理學分級。

1.4 基于TCGA、GTEx數據庫分析LRP1在Pca組織中的表達

利用腫瘤基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）（https：//portal.gdc.c-ancer.gov/） 數 據 庫 下 載LRP1基因在前列腺癌和癌旁正常組織中的表達數據。共搜集545例患者信息，其中癌組織493例，癌旁正常組織 52 例。在 GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/）網站上對TCGA數據庫和GTEx數據庫的LRP1基因表達數據進行整合（包括492例前列腺癌組織和152例癌旁正常組織），于GEPIA網站對整合后的數據進行繪圖［17］。

1.5 LRP1基因的網絡互作分析

通過 String網站（https：//string-db.org/）構建LRP1基因蛋白質相互作用網絡（protein-protein interaction network，PPI），分析其與LRP1的關聯且在KEGG通路中顯示參與前列腺癌通路的相關基因［18］，并對相關基因進行統計分析。

1.6 統計學方法

采用STATA 15.1和SPSS 22.0軟件進行數據分析。Logistic回歸計算OR值和95%CI來估算SNP與前列腺癌發病的關聯；采用χ2檢驗分析不同組織的染色表達差異；兩組計量資料比較采用獨立樣本t檢驗，多組間采用單因素方差分析；網絡互作分析在GEPIA網站中進行，采用Pearson檢驗進行相關性分析［17］。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LRP1基因SNP與Pca遺傳易感性的關系

共驗證9個候選SNP，其中外顯子測序的2個SNP未在ChinaPca數據庫中提取到數據；GWAS Catlog的7個SNP在ChinaPca數據中均提取到相關基因型數據，對這7個SNP進行分析，結果顯示rs11172113可能與前列腺癌發病有關（P=0.083），rs11172113雜合子TC基因型是Pca發病的危險因素（OR=1.267，95%CI：1.066～1.505，P=0.007），見表 2。

表2 rs11172113在ChinaPca GWAS數據中的驗證結果Tab.2 rs11172113 in ChinaPca GWAS data validation results

2.2 免疫組化檢測結果

免疫組化檢測結果顯示，前列腺癌癌組織與癌旁正常組織中LRP1的陽性表達率差異無統計學意義（P=0.167）；前列腺炎與癌旁正常組織的LRP1陽性表達率差異亦無統計學意義（P＞0.999）。見表3。鏡下可見LRP1在癌旁正常組織中的染色程度較深，而在癌組織及前列腺炎組織染色程度較淺，見圖1。

表3 免疫組化檢測LRP1在不同前列腺組織中的表達Tab.3 Immunohistochemical analysis of LRP1 expression in different prostate tissues

圖1 免疫組化檢測LRP1在不同前列腺組織中的表達（DAB染色×200）Fig.1 Expression of LRP1 in different prostate tissues was detected by immunohistochemistry（DAB×200）

2.3 TCGA、GTEx數據庫中LRP1基因的表達

在TCGA數據庫中，LRP1在前列腺癌和癌旁組織中的表達量分別為12.105±0.904和12.150±0.786，差異無統計學意義（P=0.729），見圖2A。進一步分析發現LRP1表達量與年齡、TNM分期、Gleason評分以及種族無關（P＞0.05），見表4。在GEPIA網站上對TCGA和GETx數據庫中LRP1基因表達量數據進行整合分析，結果顯示LRP1在前列腺癌組織中的表達量低于癌旁正常組織（P＜0.05），見圖2B。

表4 基于TCGA數據庫分析Pca組織LRP1表達與臨床病理特征的關系Tab.4 Relationship between LRP1 level and clinical information in Pca based on TCGA database

圖2 LRP1基因在Pca癌組織和癌旁正常組織中的表達Fig.2 Expression of LRP1 gene in Pca tissues and adjacent normal tissues

2.4 LRP1蛋白質相互作用網絡分析結果

通過String網站構建LRP1基因PPI網絡，發現3個基因與LRP1相互聯系且在KEGG通路分析參與前列腺癌通路，分別為組織型纖溶酶原激活物（PLAT）、血小板衍生生長因子亞基B（PDGFB）和血小板衍生生長因子受體-β（PDGFRB），見圖3。在GEPIA網站進行Pearson分析，結果顯示PDGFB基因、PDGFRB基因和PLAT基因表達均與LRP1基因呈正相關（r=0.74，P<0.001；r=0.40，P<0.001；r=0.093，P=0.018）。3個基因在前列腺癌癌組織中的表達量均低于癌旁正常組織（P＜0.05），見圖 4。

圖3 基于String網站構建LRP1蛋白質相互作用網絡Fig.3 Protein interaction network for LRP1 builted on the String website

圖4 基于TCGA和GTEx數據庫分析PLAT、PDGFB、PDGFRB基因在Pca組織和癌旁正常組織中的表達Fig.4 Expression of PLAT,PDGFB and PDGFRB genes in Pca tissues and adjacent normal tissues based on TCGA and GTEx databases

3 討論

前列腺癌的發病是一個復雜的過程，目前致病機制仍不清楚。LRP1有胞吞和傳遞信號的作用，對腫瘤微環境形成有重要作用［19］。本研究從LRP1單核苷酸多態性和LRP1基因表達量兩方面探討LRP1在前列腺癌發病中的作用。GWAS是在全基因組范圍內找出存在的序列變異，即單核苷酸多態性（SNP），從中篩選出致病位點。ChinaPca GWAS數據庫是目前我國最大的前列腺癌全基因組數據庫，發表了多篇關于前列腺癌SNP研究文章［5，20］。本研究通過該數據庫驗證了7個LRP1基因的SNP，發現LRP1基因rs11172113的TC雜合子突變基因型是前列腺癌發病的危險因素，提示rs11172113位點可能是前列腺癌的遺傳易感位點。

本研究免疫組化檢測結果顯示，LRP1在癌旁正常組織呈中等強度陽性，而在前列腺癌癌組織呈弱陽性，與國外研究結果一致［21］，但LRP1在前列腺癌癌組織與癌旁正常組織中的表達未顯示統計學差異性，可能與樣本量較少有關。本研究還從TCGA數據庫中搜集了LRP1基因的表達量數據進行統計分析，結果亦顯示LRP1基因在前列腺癌癌組織和癌旁正常組織中的表達量差異無統計學意義。因TCGA數據庫的前列腺正常組織例數較少，為排除其可能導致的統計學偏差，本研究在GEPIA網站中整合了TCGA和GTEx數據庫數據進行分析，結果顯示LRP1在前列腺正常組織中的表達量高于前列腺癌癌組織，與免疫組化結果一致，說明LRP1在前列腺癌癌組織中呈低表達，且可能參與前列腺癌的發生發展。

有研究發現LRP1可通過激活ERK通路和抑制JNK通路而促進癌細胞侵襲［22］，ERK通路和JNK通路是參與前列腺癌發生發展的重要通路［23］。本研究在String網站上構建LRP1的蛋白質相互作用網絡，發現LRP1與PLAT、PDGFB和PDGFRB相關，同時KEGG通路顯示3個基因均參與前列腺癌相關通路，統計分析結果提示LRP1表達與3個基因呈正相關，且前列腺癌癌組織和癌旁組織中3個基因的表達量差異顯著。

綜上所述，LRP1基因的rs11172113位點可能是前列腺癌的遺傳易感性位點。LRP1在前列腺癌癌組織中低表達，且可能通過調節PLAT、PDGFB和PDGFRB基因表達調控前列腺癌相關通路，從而導致前列腺癌發病。但本研究僅基于數據庫分析，其具體作用機制還需開展基礎實驗和臨床試驗進一步研究。