廣西HBV相關肝細胞癌及其癌旁組織中HBV S基因突變分析

李紅 吳玲紅 鄧偉 黃有全 韓簫 梁善雄 黃天壬，

作者單位：530021 南寧 1廣西醫科大學；2廣西醫科大學附屬腫瘤醫院實驗研究部；3廣西壯族自治區腫瘤防治研究所

原發性肝癌（以下簡稱肝癌）是全球第4大癌癥死亡原因［1］。2015年廣西肝癌發病和死亡例數分別位居惡性腫瘤發病和死亡的第2位和第1位［2］。肝細胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）占肝癌的 75%～85%［1］，是最常見的組織學類型。HCC發生是多因素、多步驟參與的復雜過程，受遺傳和環境因素雙重影響，其中HBV慢性感染是主要危險因素［3］。據報道，我國乙肝表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）攜帶者約1.2億［4］。HBV DNA是由正鏈和負鏈組成的不完整雙鏈結構，包含4個開放讀碼框（open reading frames，ORF），分別為 preS/S 區、preC/C 區、P 區和 X區。ORF突變可改變病毒的復制與毒性，導致病毒持續感染及肝臟嚴重損傷，甚至可導致HCC發生發展。其中HBV preS/S區由preS1、preS2和S 3個區域組成，編碼3種HBsAg，即大分子蛋白（large hepatitis B surface protein，LHBs）、中分子蛋白（middle hepatitis B surface proteins，MHBs）和小分子蛋白（small hepatitis B surface proteins，SHBs）［5］。LHBs由preS1、preS2、S基因編碼；MHBs由preS2、S基因編碼；SHBs即HBV主蛋白，由S基因編碼［6］。近年來，多項研究表明HBVS基因突變與HCC發病密切相關［7-9］。但由于組織樣本難以獲取，大多研究在血清中進行S基因突變分析。本研究分析肝細胞癌組織HBVS基因及其所編碼蛋白的突變情況，為闡明HCC發病機制提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2015年1月至2016年12月于廣西醫科大學附屬腫瘤醫院手術切除的43例HCC患者癌組織及其癌旁組織（距手術切緣大于2 cm），均經病理學檢查確診。納入標準：HBV相關HCC，首次就診；HBV DNA陽性且定量大于1 000 IU/mL；術前未經抗癌治療。排除合并其他腫瘤、藥物性肝病、酒精性肝病、丙型肝炎病毒感染等患者。共43例患者符合標準納入研究，其中男性 37例，女性 6例，平均年齡（49.8±10.1）歲，中位年齡50歲（范圍：25～69歲）。血清谷丙轉氨酶（serum alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate amino transferase，AST）中位水平分別為44.00 U/L 和 51.00 U/L；血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）中位水平為178.4 ng/mL。HBsAg、乙型肝炎E抗原（hapatitis B e antigen，HBeAg）陽性率分別為97.67%和16.28%。本研究經廣西醫科大學附屬醫院倫理委員會批準，患者或監護人知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 HBV DNA提取 按HBV DNA提取試劑盒（購自上海天根生化科技公司，貨號為DP304）說明書提取DNA，NanoDrop2000超微量樣本分光光度計檢測DNA濃度與純度。

1.2.2 HBVS基因擴增 采用巢式PCR擴增HBVS基因，全長約586 bp。第一輪反應上游引物為5′-GGGTCACCATATTCTTGGG-3′，下游引物為 5′-GACCCACAATTCTTTGACAT-3′。反應條件：預變性95℃ 2 min；變性95℃ 35 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，共30個循環；終末循環72℃10 min。第二輪反應上游引物為 5′-GCGGGGTTTTTCTTGTTGA-3′，下游引物為5′-GGGACTCAAGATGTTGTACAG-3′。反應條件同第一輪反應。

1.2.3 目的產物鑒定與序列測定 以DNA marker作為對照，10 g/mL瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物，目的條帶產物由北京六合華大基因股份有限公司進行雙向測序。

1.3 序列分析

采用Chromas軟件分析序列峰圖，鑒定測序結果。DNAMAN軟件比對樣品序列和NCBI上NC_003977.2 HBV序列；樣品序列和NC_003977.2 HBV序列對齊（nt247-771，大小525 bp）進行氨基酸翻譯，共175個氨基酸，對應SHBs第31～205位氨基酸。同一位點突變頻率超過所有序列數的10%視為熱點突變。

1.4 統計學方法

采用SPSS 24.0軟件進行數據分析。分類數據組間比較采用完全隨機設計的χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBV S基因擴增及測序結果

43對HCC癌組織及癌旁組織樣本均成功擴增，擴增產物凝膠電泳在586 bp處出現亮條帶，與目的片段長度相符，見圖1。擴增產物測序后分別獲得43條癌組織序列和43條癌旁組織序列。

圖1 部分組織樣本HBV S基因瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of agarose for HBV S gene

2.2 HBV S基因熱點突變

共116個位點發生突變，其中癌組織有96個位點發生突變，癌旁組織有95個位點發生突變。共發現45個熱點突變，所有患者癌組織及其癌旁組織序列均檢測到熱點突變，并非某一組織所特有，任一熱點突變在癌組織與癌旁組織中的分布差異無統計學意義（P＞0.05）。其中，癌組織與癌旁組織的所有序列均存在T291A、A292C和C520A突變，見表1。

表1 HBV相關HCC患者癌組織及其癌旁組織的熱點突變［n（%）］Tab.1 Analysis of hot spot mutations of HCC and pericarcinoma liver tissues in patients with HBV-related HCC［n（%）］

2.3 HBV SHBs終止突變

用DNAMAN軟件行氨基酸翻譯，共發現6條序列由于堿基突變發生終止突變，導致SHBs肽鏈合成提前終止。在43條癌組織序列中，有6條序列發生SHBs終止突變，突變發生率為13.95%（6/43），癌旁組織未發生此突變（0/43），兩者突變發生率差異有統計學意義（P＜0.05）。在 6條序列中，編碼第69位、74位、94位、172位和182位氨基酸的密碼子突變為終止密碼子，導致SHBs截短性變異，見表2。

3 討論

HBV是突變頻率最高的DNA病毒，因為HBV DNA在復制過程中缺乏DNA酶的校正功能［10］。S區與P區完全重疊，長期使用核苷（酸）類似物［nucleos（t）ide Analogues，NAs］引起的耐藥突變可間接導致S基因突變，S基因突變也可引起P區基因組突變［11］，HBsAg蛋白氨基酸變異也可影響病毒對藥物的反應［12］。在SHBs中，第99～169位氨基酸序列區構成了SHBs的主要親水區（major hydrophilic region，MHR），其中包括“α 決定簇（aa124～147）”。α 決定簇是重要的抗原決定表位，可刺激B細胞產生中和性抗體，S基因MHR氨基酸的替換降低了乙肝表面抗體的結合，導致免疫逃逸［13］和隱匿性HBV感染（occult hepatitis B virus infection，OBI）。sG145R 突變是S基因最常見的突變，已被證實具有復制能力，可以長期穩定存在，并垂直或水平傳播［14-17］。sG145R、sK122I和其他發生在SHBs α決定簇中的免疫逃逸突變，如sT123N突變，可能影響HBsAg分泌［18-19］。S基因MHR逃逸突變可能阻礙HBsAg的表達分泌，使HBsAg匯集在肝細胞內，對細胞產生毒性效應，導致肝損傷，從而促進HCC發?。?0］。本研究發現 T291A、A292C、C520A在HCC癌組織與癌旁組織所有序列中均發生突變，而C520A/G521A雙突變存在于癌組織的全部序列中，且C520A、G521A突變在MHR內，提示C520A/G521A突變可能造成免疫逃逸，影響HBsAg持續分泌，從而促進HCC發生發展。然而HCC癌組織與癌旁組織熱點突變發生率差異無統計學意義，同一患者中，HBVS基因熱點突變在HCC癌組織及其癌旁組織中的分布并無特異性。這一結果可能由于S基因處于HBV基因組高度保守區導致，也可能由于抽樣誤差或樣本量較少等原因造成。

表2HCC癌組織中SHBs蛋白終止突變的特點Tab.2 Characteristics of SHBs stop mutation in HCC tissues

本研究還發現SHBs終止突變僅發生在HCC癌組織中，但癌旁組織未發生此突變，6條序列中5個位點發生了終止突變，分別是 sC69*、sW74*、sL94*、sW172*和 sW182*。其中 sC69*、sW172*和 sW182*已有研究報道［8，20-21］，但 sW74*、sL94*突變尚未見報道，提示sW74*、sL94*可能是地域性特有的終止突變模式。終止突變主要由于RT區耐藥突變，使S基因發生突變［20］，導致SHBs截短。終止突變也可在自然條件下發生，但未接受核苷（酸）類藥物治療患者突變檢出率較低［22］。終止突變可造成免疫逃逸而促進肝臟疾病發生。此外，截短的蛋白質在內質網中滯留而誘發內質網應激反應，如HBV sW172*截短變異體可導致HBsAg分泌缺陷，HBsAg在ER內滯留，通過激活ER應激信號通路參與HCC發生［23］。

綜上所述，廣西HCC癌組織及其癌旁組織HBVS基因熱點突變分布無特異性，SHBs終止突變常發生于HCC癌組織中，新發現了sW74*和sL94*終止突變位點，可能與HCC發生發展密切相關，這一結果為廣西HCC研究提供新的方向。但鑒于本研究樣本量較少，有關結論尚需進一步驗證。