IncRNA MAFG-AS1及miR-143-3p對宮頸癌細胞增殖、凋亡的影響及機制研究

趙晨陽 李瓊

作者單位：423000 郴州 郴州市第一人民醫院1婦科，2產科

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，人乳頭狀瘤病毒（HPV）持續感染是其發生的主要原因［1-2］。研究發現lncRNA異常表達與宮頸癌的惡性表型及不良預后密切相關，微小RNA（miRNA）也與宮頸癌發生、侵襲、轉移和復發等相關，可作為宮頸癌診斷、預后評估的重要指標和治療的潛在靶點［3-4］。MAFG反義RNA 1（MAFG-AS1）是一種lncRNA，在非小細胞肺癌中表達上調［5］。MO 等［6］基于 lncRNA 蛋白編碼基因共表達網絡的lncRNA功能注釋發現MAFG-AS1與胃癌代謝相關過程有關。MAFG-AS1在骨肉瘤細胞中高表達，下調MAFG-AS1表達可抑制骨肉瘤細胞增殖［7］。但lncRNA MAFG-AS1與宮頸癌的關系尚未見報道。研究發現miR-143可通過靶向K-ras抑制宮頸癌Hela細胞增殖［8］。TargetScan數據庫預測顯示lncRNA MAFG-AS1 3′UTR區域與miR-143-3p有結合位點。本文探討lncRNA MAFG-AS1對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響，及其是否通過靶向調控miR-143-3p發揮作用，為宮頸癌精準靶向治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集郴州市第一人民醫院2016年1月至2019年1月手術切除的20例宮頸癌組織及相應癌旁正常組織。納入標準：⑴經病理組織學檢查確診；⑵術前1個月未經放化療。排除合并其他惡性腫瘤者及有嚴重心、肝、腎等器官功能障礙者。本研究經郴州市第一人民醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 主要材料和儀器

宮頸癌細胞Hela購自中國科學院上海細胞庫。Lipofec-tamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒、二甲基亞砜（DMSO）、BCA試劑盒購自Sigma公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒、RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；所有抗體均購自上海煊翎生物科技有限公司；Thermo FC酶標儀購自美國Thermo公司；FACS caliber流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3 細胞培養

宮頸癌細胞Hela用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養，待細胞融合至60%～70%時，加入胰蛋白酶，消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.4 細胞轉染與分組

取常規培養的宮頸癌Hela細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后接種于96孔板中，待細胞生長至80%融合度時轉染。將 miR-NC、miR-143-3p、si-NC、si-MAFGAS1、pcDNA和pcDNA-MAFG-AS1分別轉染宮頸癌Hela細胞，并分別記為miR-NC組、miR-143-3p mimics組、si-NC組、si-MAFG-AS1組、pcDNA組和 pcDNAMAFG-AS1組；將si-MAFG-AS1分別與anti-miR-NC和anti-miR-143-3p共同轉染宮頸癌Hela細胞，記為si-MAFG-AS1+anti-miR-NC組和si-MAFG-AS1+anti-miR-143-3p組，按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒轉染。

1.5 qRT-PCR檢測miR-143-3p和MAFG-AS1 mRNA的表達水平

收集以上各組細胞，提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，按照TaKaRa熒光定量試劑盒使用說明配制反應體系。miR-143-3p和MAFGAS1分別以U6和GAPDH為內參進行PCR擴增，每個樣品重復3次。反應條件：95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環；60℃延長5 min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。miR-143-3p正向引物序列：5'-GGGGTGAGATGAAGCACTG-3'，反向引物序列：5'-CAGTGCGTGTCGTGCAGT-3'；U6 正向引物序列：5'-CGCTTCGGCACATATAC-3'，反向引物序列：5'-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；MAFG-AS1 正向引物序列：5'-CGGGAGGAAGATAAACGGGG-3'，反向引物序列：5'-TGACCACGGAACACCTTCAG-3'；GAPDH 正向引物序列：5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'，反向引物序列：5'-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3'。

1.6 Western blot檢測蛋白表達情況

收集以上各組細胞，BCA試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入兔抗人Cyclin D1抗體（稀釋比例為1:1 000）、兔抗人p21抗體（稀釋比例為 1:800）、兔抗人p27抗體（稀釋比例為 1:800）、兔抗人Bcl-2抗體（稀釋比例為1:800）、兔抗人Bax抗體（稀釋比例為1:800）、兔抗人Cleaved-Caspase-3抗體（稀釋比例為1:1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗（稀釋比例為 1:2 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，曝光顯影。采用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。每個蛋白樣品重復3次。

1.7 MTT實驗檢測細胞增殖情況

以上各組細胞培養至24 h、48 h、72 h時加入20 μL（5 g/L）MTT 溶液，繼續孵育 4 h；加入 150 μL DMSO振蕩10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度值（OD）。細胞增殖率（%）=［實驗組OD值/空白對照組OD值］×100%。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

用不含EDTA的胰酶消化各組細胞并重懸。按試劑盒說明書先后加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育15 min。流式細胞儀檢測激發波長488 nm處和發射波長530 nm處熒光強度。實驗重復3次。

1.9 熒光素酶報告基因檢測實驗檢測MAFG-AS1對miR-143-3p的靶向調控

TargetScan數據庫顯示MAFG-AS1 3′UTR區域存在miR-143-3p結合位點。構建野生型和突變型基因靶點 MAFG-AS1的 3′UTR-熒光素酶表達載體（WT-MAFG-AS1和MUT-MAFG-AS1），取對數生長期宮頸癌Hela細胞接種于24孔板（5×104個/孔），待細胞生長至80%融合度時，將WT-MAFG-AS1和MUT-MAFG-AS1轉染Hela細胞，然后再分別轉染miR-143-3p和miR-NC。隨后進行雙熒光素酶報告實驗測定，實驗結果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進行統計學分析。實驗重復3次。

1.10 統計學方法

采用SPSS 20.0進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統計學意義，進一步的多重比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MAFG-AS1和miR-143-3p在不同宮頸癌組織和細胞中的表達

qRT-PCR檢測結果顯示，與癌旁正常組織相比，宮頸癌組織中MAFG-AS1 mRNA表達水平升高（0.905±0.115vs2.835±0.164，t=43.091，P<0.001，圖 1A），miR-143-3p表達水平降低（0.944±0.075vs0.382±0.071，t=24.336，P<0.001，圖 1B）；與正常宮頸細胞株相比，宮頸癌細胞Hela中MAFG-AS1 mRNA的表達升高（P<0.001，圖 1C），miR-143-3p表達降低（P<0.001，圖 1D）。

圖1 MAFG-AS1和miR-143-3p在不同宮頸癌組織和細胞中的表達Fig.1 Expressions of MAFG-AS1 and miR-143-3p in cervical cancer tissues and cell lines

2.2 下調MAFG-AS1表達抑制宮頸癌Hela細胞的增殖活性

qRT-PCR檢測結果（圖2A）顯示，與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組Hela細胞中 MAFG-AS1 mRNA的表達水平顯著降低（t=18.581，P<0.001）。MTT法檢測結果（圖2B）顯示，與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組Hela細胞增殖活性顯著降低（t48h=11.713，P48h<0.001；t72h=13.904，P72h<0.001）。Western blot檢測結果（圖2C）顯示，與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組Hela細胞Cyclin D1蛋白表達水平顯著降低（t=13.396，P<0.001），而p21和p27蛋白表達水平顯著升高（tp21=13.396，Pp21<0.001；tp27=15.949，Pp27<0.001）。

圖2 下調MAFG-AS1表達對宮頸癌Hela細胞增殖活性的影響Fig.2 Effect of down-regulation of MAFG-AS1 expression on proliferation of cervical cancer Hela cells

2.3 下調MAFG-AS1表達促進宮頸癌Hela細胞凋亡

流式細胞儀檢測結果（圖3A）顯示，si-MAFG-AS1組Hela細胞凋亡率高于 si-NC 組（21.43±2.14vs6.57±0.68，t=19.854，P<0.001）。Western blot檢測結果（圖3B）顯示，與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組Hela細胞Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（t=20.572，P<0.001），Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平顯著升高（tBax=13.768，PBax<0.001；tCleaved-Caspase-3=16.994，PCleaved-Caspase-3<0.001）。

2.4 miR-143-3p過表達對宮頸癌Hela細胞增殖活和凋亡的影響

qRT-PCR檢測結果（圖4A）顯示，與miR-NC組相比，miR-143-3pmimics組 Hela細胞 miR-143-3p的表達水平顯著升高（t=19.409，P<0.001）。MTT法檢測結果（圖4B）顯示，miR-143-3p mimics組Hela細胞增殖活性較miR-NC組顯著降低（t48h=7.905，P48h<0.001；t72h=10.535，P72h<0.001）。流式細胞儀檢測結果（圖4C）顯示，相較miR-NC組，miR-143-3p mimics組Hela細胞凋亡率顯著升高［（7.46±0.69）%vs（19.37±1.84）%，t=18.182，P<0.001］。Western blot檢測結果（圖 4D）顯示，與miR-NC組相比，miR-143-3p mimics組Hela細胞Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（tCyclinD1=11.649，PCyclinD1<0.001；tBcl-2=15.205，PBcl-2<0.001），p21、Bax蛋白表達水平顯著升高（tp21=17.493，Pp21<0.001；tBax=14.575，PBax<0.001）。

圖3 下調MAFG-AS1表達對宮頸癌Hela細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of down-regulation of MAFG-AS1 expression on apoptosis of cervical cancer Hela cells

2.5 MAFG-AS1靶向調控miR-143-3p的表達

熒光素酶報告基因檢測實驗結果（圖5A）顯示，與miR-NC組比較，轉染miR-143-3p的WT-MAFG-AS1 Hela細胞熒光素酶活性顯著降低（t=17.972，P<0.001）；轉染miR-143-3p的MUT-MAFG-AS1 Hela細胞熒光素酶活性差異無統計學意義（t=0.498，P=0.625）。qRT-PCR檢測結果（圖5B）顯示，相較于pcDNA組，pcDNA-MAFG-AS1組細胞miR-143-3p表達水平顯著降低（t=10.198，P<0.001）；si-MAFG-AS1 組細胞miR-143-3p表達水平較si-NC組顯著升高（t=21.477，P<0.001）。

2.6 抑制miR-143-3p表達可逆轉下調MAFG-AS1表達對Hela細胞增殖和凋亡的影響

qRT-PCR檢測結果（圖6A）顯示，與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組Hela細胞miR-143-3p的表達水平顯著升高（t=16.312，P<0.001）；與 si-MAFG-AS1+antimiR-NC組相比，si-MAFG-AS1+anti-miR-143-3p組Hela細胞miR-143-3p的表達水平顯著降低（t=10.651，P<0.001）。MTT法檢測結果（圖6B）顯示，與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組Hela細胞增殖活性顯著降低（t48h=11.245，P48h<0.001；t72h=14.945，P72h<0.001）；與 si-MAFGAS1+anti-miR-NC組相比，si-MAFG-AS1+anti-miR-143-3p組Hela細胞增殖活性顯著升高（t48h=7.965，P48h<0.001；t72h=11.347，P72h<0.001）。流式細胞儀檢測結果（圖6C）顯示，相較于si-NC組，si-MAFG-AS1組Hela細胞凋亡率顯著升高［（7.25±0.71）%vs（22.43±2.48）% ，t=17.654，P<0.001］； 與 si-MAFG-AS1+antimiR-NC組相比，si-MAFG-AS1+anti-miR-143-3p組Hela細胞凋亡率顯著降低 ［（23.69±2.51）%vs（14.76±1.52）%，t=9.130，P<0.001］。Western blot檢測結果（圖6D）顯示，與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組Hela細胞Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低（tCyclinD1=15.372，PCyclinD1<0.001；tBcl-2=22.687，PBcl-2<0.001），而p21、Bax蛋白表達水平顯著升高（tp21=16.012，Pp21<0.001；tBax=14.14，PBax<0.001）；與 si-MAFG-AS1+antimiR-NC組相比，si-MAFG-AS1+anti-miR-143-3p組Hela細胞Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達水平顯著升高（tCyclinD1=12.540，PCyclinD1<0.001；tBcl-2=17.755，PBcl-2<0.001），p21、Bax蛋白的表達水平顯著降低（tp21=10.776，Pp21<0.001；tBax=9.303，PBax<0.001）。

圖4 miR-143-3p過表達對宮頸癌Hela細胞增殖和凋亡的影響Fig.4 Effect of miR-143-3p overexpression on proliferation and apoptosis of cervical cancer Hela cells

圖5 MAFG-AS1靶向調控miR-143-3p表達Fig.5 MAFG-AS1 targeted the regulation of miR-143-3p expression

3 討論

研究報道分子靶向藥物在宮頸癌治療中具有巨大潛力［9］。CUI等［10］研究發現 MAFG-AS1 在結直腸癌中表達上調，MAFG-AS1可通過調控miR-147b和NDUFA4表達而促進結直腸癌細胞增殖、侵襲和細胞周期進程，并抑制細胞凋亡。lncRNA MAFG-AS1在非小細胞肺癌組織和細胞中表達亦上調，且可通過調控miR-339-5p/MMP15促進細胞遷移和侵襲［11］。本研究結果發現MAFG-AS1在宮頸癌細胞中呈高表達，下調MAFG-AS1表達可抑制宮頸癌Hela細胞增殖活性，促進細胞凋亡；且抑制增殖相關蛋白Bcl-2和Cyclin D1表達，促進凋亡相關蛋白 Bax、Cleaved-Caspase-3、p21、p27表達。

miRNA在宮頸癌的發生發展過程中發揮著重要作用［12］。研究發現在宮頸癌組織和細胞中miR-143-3p低表達，上調miR-143-3p表達可抑制宮頸癌細胞增殖，促進細胞凋亡［13］。E3泛素連接酶可通過靶向miR-143促進宮頸癌生長［14］。miR-143-3p也參與了各種癌癥進展，如miR-143-3p可促進肝細胞癌進展［15］，抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲［16］。在乳腺癌細胞中miR-143-3p表達顯著下調，過表達miR-143-3p可抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲［17］。本研究結果同樣顯示miR-143-3p在宮頸癌細胞中低表達，miR-143-3p過表達可抑制宮頸癌Hela細胞增殖活性，促進細胞凋亡。

圖6 抑制miR-143-3p表達逆轉了下調MAFG-AS1表達對Hela細胞增殖活性和凋亡的影響Fig.6 Inhibition of miR-143-3p expression reversed the effect of down-regulating MAFG-AS1 expression on proliferation and apoptosis of Hela cells

研究發現lncRNA主要作為miRNA的前體，與miRNA競爭性結合mRNA及通過“海綿效應”調控miRNA；而miRNA可直接結合lncRNA或通過中間因子間接調控lncRNA，兩者共同形成一個復雜的調控網絡［18］。研究發現lncRNA MAFG-AS1可通過調控miR-147b和miR-339-5p而影響結腸癌和非小細胞肺癌的進展［12-13］。lncRNA-UCA1可以靶向調節mi-R143而影響前列腺癌細胞增殖和凋亡［19］；lncRNA-SARCC通過改變miR-143-3p信號抑制腎細胞癌進展［20］。本研究發現lncRNAMAFG-AS1可靶向調控miR-143-3p表達，且抑制miR-143-3p表達能逆轉下調MAFG-AS1對Hela細胞抑制增殖和促進凋亡作用。

綜上所述，lncRNA MAFG-AS1可抑制宮頸癌細胞增殖，促進細胞凋亡，可能與靶向miR-143-3p有關，lncRNA MAFG-AS1有望成為宮頸癌的預防和治療新靶點。但本實驗僅在細胞水平進行研究，且lncRNA MAFG-AS1調控miR-143-3p而影響宮頸癌細胞增殖和凋亡的下游分子機制仍需進一步研究。