谷胱甘肽的合成、代謝對早產兒腦損傷的影響

彭春媛，劉江勤

(1.同濟大學附屬第一婦嬰保健院新生兒科，上海 201204；2.寧波市婦女兒童醫院新生兒科，浙江 寧波 315012)

關鍵字:早產兒腦損傷；谷胱甘肽；核轉錄因子紅系2相關因子2；抗氧化應激;抗氧化屏障

隨著新生兒重癥監護技術的不斷發展，早產兒特別是極低出生體重兒的存活率大大提高。而早產兒腦損傷的發生也相應增多，作為影響早產兒遠期神經系統發育的主要原因，其主要病因包括缺氧缺血、感染、低血糖、機械通氣、高膽紅素血癥等[1]。造成早產兒腦損傷的機制包括興奮毒性損傷和自由基損傷，其中自由基包括活性氧(超氧陰離子、羥基自由基、過氧化氫等)和活性氮(一氧化氮及其衍生物)。當自由基產生增加，抗氧化儲備快速消耗，細胞蛋白、脂質和DNA被氧化，產生一系列生理、病理反應，即為氧化應激。早產兒對氧化應激特別敏感，常導致嚴重腦損傷。為抵抗氧化應激損傷，機體在不斷進化中形成了一系列防御屏障。其中，谷胱甘肽在正常條件下能清除氧自由基，可與毒性代謝產物直接反應，或通過相關酶的作用將過氧化氫還原成水和氧，從而發揮抗氧化作用[2]。另外，谷胱甘肽也可作為一種金屬結合蛋白，維持細胞內環境穩態和細胞正常代謝[3]。現就谷胱甘肽的合成、代謝對早產兒腦損傷的影響予以綜述。

1 谷胱甘肽合成、代謝的主要相關酶

在谷胱甘肽的合成、代謝過程中，有幾種關鍵酶參與了其中。細胞膜上的谷氨酸/胱氨酸轉運體(glutamate/cystine transporter，xCT)將胱氨酸轉運進入細胞，用于合成谷胱甘肽和含有半胱氨酸的蛋白。在細胞內，谷氨酸-半胱氨酸連接酶(glutamate cysteine ligase，GCL)攝取胱氨酸合成谷胱甘肽，維持細胞的抗氧化能力。谷胱甘肽過氧化物酶將谷胱甘肽氧化成為氧化型谷胱甘肽，同時谷胱甘肽在過氧化氫酶的作用下將過氧化氫還原成為水。而氧化型谷胱甘肽在依賴還原型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶1的作用下重新還原成為谷胱甘肽。谷胱甘肽的這個合成、代謝過程是機體重要的抗氧化屏障功能之一。

在谷胱甘肽的合成過程中，xCT的重要功能是將細胞外的胱氨酸轉移進入細胞，用于合成谷胱甘肽，并將細胞內的谷氨酸轉運出細胞外，實現神經遞質信號轉導。另外，xCT在神經細胞的發育過程中有重要作用，xCT部分失活的星形膠質細胞在體外培養時失去增殖能力。在體外培養的未成熟神經元和少突膠質細胞前體細胞表達的xCT水平明顯低于成熟細胞，說明未成熟的神經細胞相較成熟神經細胞更易受到損傷[4]。xCT在神經細胞上的表達差異較大，研究顯示小鼠神經細胞xCT的催化亞單位在神經元、少突膠質細胞和小膠質細胞上表達，但在星形膠質細胞上不表達，若抑制xCT的表達會導致谷胱甘肽耗竭，神經元退行性變和脫髓鞘，細胞穩態被破壞[5]。另有研究發現，小鼠xCT主要在星形膠質細胞上表達，在神經元不表達，通過上調細胞膜上的xCT表達能促進星形膠質細胞攝取胱氨酸，可提高谷胱甘肽的產量，從而使周圍神經細胞具有抗氧化應激能力[6]。砷處理的小膠質細胞通過競爭性抑制xCT引起細胞外胱氨酸/谷氨酸不平衡，即培養液中的胱氨酸含量減少，谷氨酸含量增加，從而導致周圍不成熟神經元細胞死亡，補充N-乙酰半胱氨酸能改善神經元存活率[7]。以上證據表明，xCT在細胞的增殖、維持穩態及促進神經細胞保護方面有重要作用。

GCL是谷胱甘肽合成的限速酶，由催化亞基和調節亞基組成，通過該酶攝取胱氨酸合成谷胱甘肽，維持細胞抗氧化能力，可實現神經保護作用[8]。谷胱甘肽的合成由多種因素控制，包括GCL的水平、兩個亞基的比例、合成谷胱甘肽的底物L-胱氨酸和細胞內谷胱甘肽水平的負反饋對GCL的抑制[9]。動物實驗發現，通過抑制大鼠GCL基因表達可導致線粒體內谷胱甘肽穩態受損，線粒體功能障礙，神經細胞減少[10]。神經細胞缺乏GCL會導致谷胱甘肽產量顯著降低，進而增加細胞對缺氧損傷的敏感性[11]。Pehar等[12]研究發現，敲除小鼠星形膠質細胞的GCL調節亞基，其總谷胱甘肽水平降低80%，從而使得對神經元的保護作用減弱。也有研究顯示，當GCL的活性持續下降時，谷胱甘肽水平也持續降低，但氧化性DNA損傷水平較高；GCL過度表達可顯著提高谷胱甘肽水平，抑制DNA氧化損傷，從而抑制腫瘤細胞的遷移和生長[13]。GCL的基因存在多態性，并影響其轉錄和表達水平，特別是當細胞處于氧化應激時，這種基因的多態性會改變細胞內谷胱甘肽的穩態，最終導致細胞容易受到氧化應激損傷。因此，實驗室常用谷胱甘肽抑制劑抑制GCL的作用，從而減少谷胱甘肽合成，且谷胱甘肽缺乏的動物模型也常采用GCL基因敲除制作。另外，GCL在細胞發育成熟過程中也起關鍵作用，敲除GCL基因的小鼠胚胎不能發育成熟，細胞發生大量凋亡，但在培養基中加入谷胱甘肽或N-乙酰半胱氨酸可促進胚球的發育。

2 核轉錄因子紅系2相關因子對抗氧化應激的調控作用

核轉錄因子紅系2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)為堿性亮氨酸鋅基轉錄因子，其是外源性有毒物質和氧化應激的感受器，也是細胞抗氧化反應的中樞調節者。它介導啟動下游編碼抗氧化蛋白和解毒酶對抗氧化應激的損害，這是一個重要的細胞防御機制。正常生理狀態下，Nrf2在細胞質內與抑制它的Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1結合，使Nrf2成為 E3泛素連接酶的適配底物，促進Nrf2泛素化繼而被26S蛋白酶體降解。當自由基、毒性物質增多時，親電子物質對Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1的半胱氨酸殘基進行修飾，引起 Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1的構象變化，進而導致Nrf2與Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1解離，此時Nrf2穩定性增加并轉入細胞核中與抗氧化特異基因啟動子區域的抗氧化反應元件結合，啟動解毒酶和抗氧化基因表達，這是Nrf2最普遍的活化方式，這一激活過程稱為Nrf2-抗氧化反應元件通路；另外，Nrf2還可以通過促分裂原活化的蛋白激酶、蛋白激酶C和磷脂酰肌醇-3-激酶等途徑磷酸化而間接激活。Nrf2調節許多細胞保護蛋白的表達，如xCT、GCL、血紅素氧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、依賴還原型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶1，這些酶參與調節谷胱甘肽的合成、代謝，有效阻斷由于谷胱甘肽缺乏、谷胱甘肽利用障礙等原因引起的神經毒性作用，從而保護機體免受活性物質及一些有毒物質的侵害[14]。一項模擬腦缺血缺氧/復氧損傷的動物實驗顯示，抑制Nrf2降解，增強其與抗氧化反應元件結合的活性，有利于大腦神經細胞缺血再灌注損傷后恢復[15]。在氧化應激損傷時，作為Nrf2的激活劑特丁基對苯二酚通過提高谷胱甘肽水平、增加Nrf2的穩定性及抑制Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1泛素化發揮其抗氧化功能，從而減輕神經細胞凋亡[16-17]。此外，有研究發現鈣上調谷胱甘肽水平起神經保護作用就是通過Nrf-2介導實現，而敲除Nrf2基因這種保護作用將消除[18]。臨床上，激活Nrf2的藥物二甲酸富馬酸也是通過增加Nrf2的活性而具有間接延緩神經元死亡的作用[19]。且Nrf2及其激活劑還可通過調節xCT的基因表達，具有神經保護作用[20]。但缺乏xCT是否會減弱Nrf2誘導的神經保護作用，尚需進一步研究。

研究發現，微RNA(microRNA，miRNA)與Nrf2、抗氧化蛋白酶之間有密切聯系[21-22]。miRNA是一類存在于動植物體內、大小為21～25nt的內源性非編碼單鏈小分子RNA。在動物細胞中，大多數miRNA通過與靶基因的信使RNA 3′非翻譯區結合阻止轉錄后的翻譯，從而起到調節基因表達的作用。在一個miR-144過表達模型中，miR-144不僅使神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞內氧自由基增加，細胞活性降低，谷胱甘肽和抗氧化酶活性降低，也使GCL催化亞基、GCL調節亞基、Nrf2表達減少[21]。有學者采用實時定量聚合酶鏈反應分析發現，心肌梗死后左心室細胞內的miR-27a、miR-28-3p和miR-34a表達水平高于其他器官，這些miRNA通過抑制Nrf2活性增加氧化應激，從而導致心力衰竭[22]。以上研究說明，miRNA可以通過對Nrf2的負性調節使細胞抗氧化能力降低。也有研究者通過建立小鼠順鉑誘導的急性腎損害模型發現，miR140-5p直接作用于Nrf2的3′非翻譯區并起著積極調節Nrf2表達的作用，且依賴還原型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶1、血紅素氧化酶的水平也明顯提高，因而細胞的抗氧化能力顯著增強[23]。可見，對miRNA調節氧化應激的深入研究，很可能為將來治療感染、腫瘤和自身免疫系統疾病提供一種全新的治療手段。

3 星形膠質細胞在抗氧化屏障中的作用

星形膠質細胞在抗氧化應激過程中有非常重要的作用，其功能受損是神經元及其他神經細胞原發性和繼發性受損的重要原因[24]。星形膠質細胞是人類大腦內數量最多的細胞，不同程度的神經損傷會激活星形膠質細胞，改變其形態及功能蛋白的表達，對周圍神經細胞產生影響，形成膠質瘢痕。在神經損傷的早期階段，激活的星形膠質細胞通過多種方式促進神經元的存活，但隨著損傷的進展，它又會抑制神經元的再生。

星形膠質細胞在神經損傷中的一個重要保護機制為其通過合成谷胱甘肽，清除損傷產生的毒性產物(氧自由基、鐵和氧化的脂質等)，從而抑制氧化應激損傷[2]。這一解毒過程需要星形膠質細胞內有足夠水平的谷胱甘肽，不同解毒過程在一定條件下相互干擾甚至相互競爭谷胱甘肽；星形膠質細胞中谷胱甘肽的合成、循環、輸出受損可能影響谷胱甘肽依賴的解毒過程，進而對星形膠質細胞產生損害，同時對其他腦細胞的抗氧化保護作用也減弱[25]。研究表明，當神經元與星形膠質細胞共培養時，其谷胱甘肽在12和24 h分別增加1.5倍和5倍，可阻斷魚藤酮和百草枯引起的胎鼠大腦皮質神經元死亡和損傷[26]。此外，共培養的星形膠質細胞還可通過食欲肽-A受體1/蛋白激酶Cα/胞外信號調節激酶1/2/谷氨酸轉運體途徑提高谷胱甘肽水平，增強抵抗缺氧低糖損傷的能力[27]。另有研究表明，磷酸腺苷激活的蛋白激酶能選擇性調節星形膠質細胞內GCL調節亞基的表達，促進谷胱甘肽合成，從而保護神經元[8]。且星形膠質細胞對新生兒的腦保護作用，還表現在它對谷氨酸的攝取，減輕谷氨酸對新生兒腦興奮性的毒性作用；在丙酮酸羧化酶的作用下，星形膠質細胞能夠合成神經遞質，促進神經元的正常發育[28]。可見，星形膠質細胞是大腦合成谷胱甘肽的主要細胞，它對周圍腦細胞起重要的保護作用。但目前對未成熟星形膠質細胞Nrf-2調節谷胱甘肽合成、代謝過程及其對損傷的反應和神經保護機制的研究相對較少，需進一步探索。

4 谷胱甘肽水平對早產兒大腦的影響

早產兒大腦的谷胱甘肽水平是否與足月兒或成人大腦有差別，目前尚沒有明確的結論。一項較大樣本的尸檢顯示，新生兒大腦的谷胱甘肽水平與老年人相似，但成年人的谷胱甘肽水平較高，推測原因為成年人接受較多的氧化應激，從而維持較高水平的谷胱甘肽[29]。一項研究通過監測不同孕周母血和出生時臍血中的氧化產物、谷胱甘肽過氧化物酶等發現，氧化酶和抗氧化酶呈負相關，故推斷谷胱甘肽參與的抗氧化系統保證了妊娠的維持[30]。在早產和受損的新生大鼠大腦中谷胱甘肽水平低于正常足月大鼠，且細胞凋亡也更嚴重[31]。這可能由于谷胱甘肽的代謝受多個代謝酶的影響，這些代謝酶水平低下，導致谷胱甘肽的合成功能不成熟，且在受到氧化應激時維持還原狀態的能力也有限。因此，當大腦皮質遭受缺氧損傷時，谷胱甘肽的儲備顯著減少，腦組織內氧化型谷胱甘肽、脂質過氧化物水平升高，而給予新生豬N-乙酰半胱氨酸(谷胱甘肽合成前體)可顯著降低新生豬大腦皮質的炎癥介質白細胞介素-1β及核因子κB水平，恢復組織谷胱甘肽儲備，起神經保護作用[32]。以上研究表明，相較于成熟個體，早產個體大腦對谷胱甘肽的合成、代謝、利用能力較弱，而通過提高谷胱甘肽合成代謝相關酶活性或提供N-乙酰半胱氨酸可改善谷胱甘肽在抗氧化應激中的作用。

5 小 結

目前，許多國內外學者致力于研究早產兒腦損傷的發生發展機制、預防治療措施，以期改善腦損傷早產兒的遠期預后。但越來越多的證據表明，早產兒大腦合成和調節谷胱甘肽的抗氧化屏障還不成熟，這可能是早產兒易發生腦損傷一個重要機制[7，33-34]。而Nrf-2介導的谷胱甘肽參與的抗氧化屏障對各種外來和內在的應激起重要的保護作用；星形膠質細胞作為腦內數量最多的細胞，它在腦細胞保護方面也起關鍵作用。相信隨著對谷胱甘肽合成、代謝過程的深入研究，其將對早產兒腦損傷的防治工作產生深遠影響。