lncRNA在動脈粥樣硬化病變中的作用研究進展

張麗娜，姚德山，沈 慧，龔開政,2※

(1.揚州大學附屬醫院心血管內科，江蘇 揚州 225001；2.揚州大學心血管研究所，江蘇 揚州 225001)

動脈粥樣硬化是心血管疾病的主要致病和死亡原因[1]。實驗研究已經確定了動脈粥樣硬化的幾個危險因素，包括高血壓、血脂異常、糖尿病、肥胖、吸煙、飲食、性別等[2]。動脈粥樣硬化的發生在一定程度上與內皮細胞功能紊亂和慢性炎癥密切相關。長期以來，人們一直關注那些能轉錄、編碼、翻譯蛋白的各種基因序列，這類哺乳動物基因組中蛋白質編碼基因的比例不足2%，但隨著二代測序的發展，發現剩下的非蛋白編碼區并非“垃圾DNA”，而是包含大量轉錄調控元件和非編碼RNA基因，且這些非編碼RNA在生物學過程中起著非常重要的作用，目前發現或預測的人非編碼基因已經超過了蛋白質編碼基因，達到4萬以上，其中主要為長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)[3]。lncRNAs是一類高度保守的序列，它們通常具有多種功能，主要包括信號轉導、分子誘餌、支架和引導核糖核酸復合體等。研究表明，lncRNAs可參與調節巨噬細胞、內皮細胞、血管炎癥和新陳代謝的功能，因此lncRNAs可能在動脈粥樣硬化的進展中具有重要的影響[4]。最近，基因組學研究揭示了一系列新的lncRNAs候選生物標志物可能有助于對動脈粥樣硬化發病機制的深入研究，現就lncRNAs在動脈粥樣硬化病變中的作用研究進展予以綜述。

1 lncRNAs的特性與功能

lncRNAs是繼微RNAs(microRNAs，miRNAs)之后的研究熱點。目前，將核苷酸長度>200 nt，無蛋白編碼功能的RNA定義為lncRNAs[5]。2015年，StLaurent等[6]依據lncRNAs的大小、來源及基因組定位，將其主要分為正義、反義、基因內、基因間、雙向 lncRNA和環狀RNA六類。最近的研究發現，lncRNAs在多種通路中均起到了關鍵的作用，主要功能包括：①基因印跡：基因印跡為表達調控的一種，能夠使2個等位基因中1個表達1個不表達(父源或母源基因)，X染色體失活特異性轉錄物是首個被發現在基因印跡中起重要作用的lncRNA；②分子誘餌：lncRNA可誘導蛋白質與其結合，從而抑制下游基因的表達；③支架或向導功能：lncRNA的支架和導向功能是目前的研究熱點，lncRNA可與蛋白質或DNA結合，將特定復合物引導到相應的位置上；④信號功能：當細胞受到某種刺激后可表現出相應的組織特異性，可成為疾病的生物學標志物[7]。雖然，目前大多數研究仍處于初級階段，希望通過對lncRNAs與動脈粥樣硬化疾病之間關系的深入探討和總結，為日后的研究奠定基礎，并為動脈粥樣硬化引起的心腦血管疾病提供新的診療思路。

2 lncRNAs在巨噬細胞和炎癥中的作用

內皮功能受損是早期動脈粥樣硬化發生的病理特征性改變之一，主要發展方式為內皮損傷刺激了單核細胞向血管壁遷移，從而損傷血管內皮進一步激活巨噬細胞，激活的巨噬細胞吞噬脂質形成泡沫細胞，又經過正反饋作用致使更多的巨噬細胞聚集，最終導致血管管腔狹窄以及粥樣斑塊破裂而發生急性缺血事件。由此可見，巨噬細胞在脂質和炎癥的聯系中起到了關鍵性的作用。有研究表明，巨噬細胞可通過自噬作用抑制炎癥反應，從而減少不穩定斑塊的發生，異常自噬與多種心血管疾病相關[8]。lncRNA可作為基因調控的新因素。Wang等[9]報告了一種被稱為自噬促進因子的lncRNA，其通過靶向調控miR-188-3p和自噬相關基因(autophagy-related gene，ATG)7來調節自噬細胞的死亡；同時發現自噬促進因子lncRNA通過調節miR-188-3p，影響ATG7的表達、自噬細胞的死亡以及心肌梗死，從而提出了由自噬促進因子lncRNA、miR-188-3p和ATG7所組成的自噬調控模式，此模式在分子水平調節中的作用可能成為心肌梗死和心力衰竭新治療策略中的潛在靶點和診斷工具。此外，lncRNAs也是哺乳動物發育中的重要調節因子。Chen等[10]研究發現，與miR-199a-5p共同調節人單核細胞/巨噬細胞分化的長鏈非編碼單核細胞RNA(long noncoding monocytic RNA，lncRNA-MC)亦不可或缺，lncRNA-MC單核巨噬細胞和人急性早幼粒白血病細胞以及CD34+造血干/祖細胞向單核/巨噬細胞分化過程中表現出增加的趨勢，且能被PU.1轉錄激活；這一研究表明，lncRNA-MC和miR-199a-5p在單核細胞/巨噬細胞分化中具有相反的作用，其中，lncRNA-MC在單核細胞/巨噬細胞的分化過程起促進作用，通過吸收miR-199a-5p并釋放ⅠB型激活素受體的表達增強pu.1的作用。另外，在一項針對冠心病患者和健康人血液樣本的分子標志物篩選研究中發現，CoroMarker獨立于已知的冠心病危險因素和其他心血管疾病，可成為最佳候選生物標志物；進一步的前瞻性研究發現，CoroMarker的靈敏度和特異度分別為76%和92.5%；功能富集分析顯示，CoroMarker與信號轉導、跨膜轉運、突觸傳遞及先天免疫呈正相關的基因聚集在一起，與炎癥呈負相關；而采用CoroMarker 小干擾RNA處理降低了培養基中促炎細胞因子(白細胞介素-1β、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α)的濃度，這一結果進一步證明了分布于循環血的囊泡和單核細胞中的CoroMarker可能作為診斷冠狀動脈粥樣硬化的重要指標[11]。也有研究人員用深度RNA測序法組裝人單核細胞來源的巨噬細胞的lncRNAs轉錄組，并通過不同的處理方式激活巨噬細胞，結果發現了巨噬細胞的活化，尤其是M1表型巨噬細胞的活化可顯著改變lncRNAs的表達譜，提示了lncRNAs在調節巨噬細胞炎癥功能中的潛在作用，為lncRNAs在動脈粥樣硬化的炎癥和巨噬細胞中的研究奠定了基礎[12]。

3 lncRNAs在內皮功能調節中的作用

內皮細胞是人體內重要的分泌器官和靶器官，在維持內環境穩態和心血管疾病的發病過程中發揮著極其重要的作用。而lncRNAs可以通過介導內皮細胞的各個環節，從而參與動脈粥樣硬化斑塊的發生發展。最近，在人類臍靜脈內皮細胞和人類皮膚微血管內皮細胞中，科學家使用1個lncRNAs微陣列芯片識別出了116種富含內皮細胞的lncRNAs，其中包括HHIP-AS1、FLI-AS1、LOC100505812/CARD8-AS、aAF161442/HSPC324和STEEL[13]，這些基因的發現證明lncRNA參與內皮細胞的調節過程。另有研究發現，lncRNA轉化生長因子-β2重疊轉錄本1能與miR-3960、miR-4488和miR-4459結合，靶向調控神經酰胺合成酶1/N-乙酰轉移酶8類和La-核糖核蛋白結構域家族成員1的表達，從而參與內皮細胞的自噬和免疫反應[14]。此外，lncRNA-p21通過與miR130b的結合以調控血管內皮細胞生長來證明自身的獨特地位[15]。而lncRNA心肌梗死相關轉錄物(myocardial infarction associated transcript，MIAT)可通過參與miR-150-5p和血管內皮生長因子的相互作用調節內皮細胞的功能。Yan等[16]研究表明，剔除MIAT可顯著改善糖尿病誘導的視網膜微血管功能障礙，抑制內皮細胞增殖、遷移和血管形成。MIAT作為競爭性內源性RNA發揮作用，并與血管內皮生長因子和miR-150-5p形成一個負反饋來調節內皮細胞的功能。lncRNA MIAT在改善糖尿病所致的腎臟微循環障礙中的關鍵作用，再次證明了lncRNAs在病理性血管生成中的作用，推動了lncRNAs在血管疾病中靶向診斷和治療的進展。此外，Lu等[17]利用微陣列分析發現了1個新的lncRNA位點100129973，它作為一種凋亡抑制劑，能通過海綿miR-4707-5p、miR-4767和lncRNA100129973上調凋亡抑制因子5和BCL2L12的表達，以減少細胞凋亡。這一證據表明，lncRNA100129973在改善內皮功能和治療凋亡相關心血管疾病中是一個極具吸引力的靶點。Wang等[18]報道，氯吡格雷可通過抑制lncRNA缺氧誘導因子1α-反義RNA 1來抑制棕櫚酸誘導的人血管內皮細胞凋亡和增殖，這一結果為氯吡格雷治療心血管疾病提供了一種新的作用機制，也證明了lncRNA缺氧誘導因子1-α-反義RNA 1在心血管疾病的發病機制中發揮著重要作用。科學家利用基因芯片、RNA干擾、RNA芯片分析、生物信息學、熒光素酶報告分析等技術發現，3-Benzyl-5-[(2-nitrophenoxy)methyl]-dihydrofuran-2(3H)-one(3BDO)作為一種新的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白激酶激活劑，自噬抑制劑，顯著降低了來源于轉化生長因子-β2的3′非翻譯區lncRNA-FLJ11812的水平；3BDO通過FLJ11812與以ATG13為靶點的miR-4459結合降低了ATG13蛋白水平，這表明lncRNAs在心血管疾病自噬中的作用主要是通過與內皮細胞自噬作用相互競爭得以實現的[19]。lncRNAs在人類基因組過程中具有調節作用，但在血管老化中的作用仍存在許多未知。在人類的動脈粥樣硬化斑塊中H19主要由內皮細胞表達，與從健康人的頸動脈取得的活檢相比，動脈粥樣硬化中的H19明顯減少，就這一發現，Hofmann等[20]建立了內皮特異性誘導的H19缺陷小鼠，通過一系列的實驗方法證明了lncRNA H19 的功能缺失不僅可以導致p16和p21上調、誘導增殖減少和衰老增加，而且可以誘導信號轉導及轉錄激活因子3磷酸化而發揮作用；且H19的缺失可以降低內皮細胞的功能，而H19的過表達改善了主動脈的內皮功能，表明lncRNA H19在控制內皮細胞老化方面具有關鍵作用。

4 lncRNAs在血管平滑肌調節中的作用

血管功能失衡是導致動脈粥樣硬化、高血壓和肺動脈高壓的主要原因，血管損傷、血管重構以及血管生成是冠狀動脈粥樣硬化疾病和腦血管疾病的主要病理過程。目前，血管平滑肌突變學說已經得到廣泛的共識，許多非編碼RNAs(如miRNAs和lncRNAs)參與了血管平滑肌細胞行為的調控也已被廣泛接受。Song等[21]通過回顧分析，確定了部分非編碼RNAs在血管損傷和重構過程中動態調控作用；闡述了miRNAs和lncRNAs在血管損傷、血管重構以及血管生成中的分子機制、臨床與診斷意義的研究進展；強調了miRNAs和lncRNAs在血管疾病中的重要作用。通過全基因組關聯分析發現，lncRNAs與冠狀動脈疾病遺傳易感性之間的關系不容忽視[22]。已被檢測到的染色體包括1p13、1q41、9p21和10q11，其中又以 9p21研究最為廣泛，該染色體上的ANRIL(antisenon coding RNA in the INK4 locus)是位于INK4基因座的長度約126 000 bps的lncRNA，ANRIL在動脈粥樣硬化多種相關細胞和組織中均有表達；ANRIL不僅可以通過編碼細胞增殖調控因子p14、p15和p16的兩種基因(細胞周期蛋白依賴性激酶2A基因和細胞周期蛋白依賴性激酶2B基因)發揮作用，還可以通過順式作用和反式作用調控血管平滑肌細胞的增殖，進而影響冠狀動脈疾病的發生發展[23]?；贑HR9P21區域的單核苷酸多態性與冠狀動脈疾病有關，科學家檢測了CHR9P21區域的變異體與鄰近基因信使RNA表達水平的關系，以及與整個基因組中其他基因的關系，結果發現由CHR9P21區域導致的冠狀動脈疾病風險變異與ANRIL轉錄物ENST00000428597信使RNA的表達顯著相關，同時也發現一些遠程轉錄與該區域的變異有關，包括眾所周知的冠狀動脈疾病風險基因腺苷三磷酸結合盒轉運體A1[24]。此外，在構建的頸動脈內膜損傷模型中，Wu等[25]發現，抑制lncRNA-p21可導致體內新生內膜的增生；通過建立動脈粥樣硬化模型發現，lncRNA-p21能夠抑制血管平滑肌細胞和小鼠單核巨噬細胞的細胞增殖，且能夠誘導細胞的凋亡；同時，也證明了冠狀動脈疾病患者的lncRNA-p21表達是降低的。另外，Leung等[26]通過對lncRNA在血管緊張素(angiotensin，Ang)Ⅱ和高血壓分子機制的研究中發現，lnc-Ang362可通過與AngⅡ的作用參與到動脈粥樣硬化中去。最近的一系列研究發現，動脈粥樣硬化斑塊發病機制相關轉錄物[27]、缺氧誘導因子1α-反義RNA1[28]、MIAT[29]、SENCR(smooth muscle and endothelial cell enriched migration/differentiation-associated long non-coding RNA)[30]等相關基因在血管平滑肌細胞的增殖和凋亡過程中也起到了極為關鍵的作用。綜上，lncRNAs是一類新的細胞增殖和凋亡調節因子，也可作為動脈粥樣硬化和相關心血管疾病的治療靶點。

5 lncRNAs在脂質代謝中的作用

脂質代謝紊亂是動脈粥樣硬化的主要危險因素之一，當脂質代謝發生紊亂時，脂質聚積在動脈內壁進而形成斑塊，斑塊的破裂和管腔的狹小最終導致血管急性事件的發生。在Cui等[31]的研究中，基于肝癌高表達(highly up-regulated in liver cancer，HULC)是第一個在肝癌中發現的lncRNA的這一發現，建立了HULC通過支持肝癌細胞中異常的脂質代謝而促進惡性發展的假說，并通過一系列的研究證實，HULC在肝癌細胞中作為一種癌基因發揮作用，其機制是通過一個涉及miR-9、過氧化物酶體增殖物激活受體α和長鏈脂酰CoA合成酶的信號通路來解除對脂質代謝的調控，從而驅動HULC信號轉導。研究證明，數百個lncRNAs參與了脂肪生成的調節網絡[32]。眾所周知，PU.1作為一種參與骨髓淋巴分化的E26特異轉錄家族轉錄因子，在脂肪細胞系中也有表達。然而，在前脂肪細胞中，PU.1信使RNA和蛋白質的表達水平與成熟脂肪細胞中的水平并不匹配。基于這一現象，Pang等[33]發現，在前脂肪細胞中，PU.1 AS(antisense)通過與PU.1信使RNA結合形成信使RNA/AS lncRNA雙鏈以阻止信使RNA翻譯，從而促進脂肪生成。新的研究證實，血漿中預測心臟重構長鏈基因間非編碼RNA(long intergenic non-coding RNA predicting cardiac remodeling，LIPCAR)的過量表達會導致脂代謝失衡，主要通過降低冠狀動脈粥樣硬化的保護因素——高密度脂蛋白膽固醇的表達發揮作用，但關于LIPCAR的作用機制需要深入的研究[34]。

6 小 結

lncRNAs從最初不被重視到現在逐漸回歸熱點，其重要性愈發突出。對lncRNAs作用機制的深入探索，有助于對動脈粥樣硬化疾病的全面把握，為動脈粥樣硬化疾病的診療奠定基礎。目前對于lncRNAs的研究雖有重大突破，但尚處于起步階段，仍需深入挖掘其結構、功能以及與冠狀動脈粥樣硬化的相關性。期望通過對lncRNAs的精準研究，可以找到預測或直接診斷冠狀動脈粥樣硬化疾病的特異性lncRNAs的靶基因，借此輔助判斷患者患病的嚴重程度，并通過基因靶向治療來預防冠狀動脈粥樣硬化的發生，逆轉冠狀動脈粥樣硬化的病理改變。相信隨著技術和檢測方法的不斷完善，lncRNA在冠狀動脈粥樣硬化中的臨床作用能夠不斷地被探尋和利用。