酪蛋白的胰蛋白酶水解物分離及其抗氧化性研究

秦娟娟，何超群，劉金龍，李 晶，楊繼濤 *，楊 敏

（1.甘肅農業大學 農業資源化學與應用研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學 理學院，甘肅 蘭州 730070）

牛乳及牛乳制品目前被認為是最適合人類食用的動物蛋白食品之一，而牛乳中占比最多的蛋白質是酪蛋白[1]。人體對蛋白質的消化過程中會產生許多種類的肽，牛乳酪蛋白不僅是優質的蛋白質，而且是生物活性肽的重要來源[2]。酪蛋白經不同酶解處理可產生不同的生物活性肽，如抑菌肽[3-4]、磷酸肽[5-6]、抗氧化肽[7]、血管緊張素轉換酶（angiotensin conversion enzyme，ACE）抑制肽[8]。其中抗氧化肽是一類具有清除體內過多的自由基、抑制脂肪氧合酶活力、分解氧化物、增強人體抗衰老和抗疾病能力的活性多肽[9-10]。

20世紀90年代來，乳源抗氧化肽的分離鑒定及其活性的研究備受國內外學者關注，并隨著質譜等技術的發展，已從多種動植物的蛋白水解產物中鑒定出大量的具有特定序列的抗氧化肽[2]。多肽的分離多采用樹脂分離技術，不同樹脂的分離機理不同，進而使其富集的多肽在分子質量、凈電荷、氨基酸組成等方面具有差異，不同分離方式其分離出肽的富集片段也各不相同。宋曉光等[11]利用D201樹脂分離了水蛭中活性肽成分，并優化了工藝參數。胡贊揚等[12]以酶凝干酪乳清為原料，通過硫酸銨沉淀、透析、超濾和D201樹脂離子交換層析等工藝，實現了乳清中糖巨肽的有效分離。大量研究指出，多肽的自由基清除力、金屬螯合力以及脂質過氧化抑制力與其氨基酸組成、氨基酸序列、分子質量和空間構象密切相關，如含有酪氨酸、色氨酸、組氨酸殘基的多肽表現出較好的自由基清除能力，而疏水性氨基酸含量較高的多肽表現出極好的脂質過氧化抑制能力[15-16]。劉麗莎等[17]利用黃漿水為原料，通過比較酶種類及用量、酶解溫度、酶解時間對黃漿水蛋白質水解度的影響，實現酶解工藝的優化，在此條件下水解度可達25.95%，血管緊張素轉化酶體外抑制活性達92.0%。

關于乳源抗氧化肽的研究較多，但因多肽的分離純化工藝復雜，成本高而難以實現產業化。本研究采用胰蛋白酶對牛乳酪蛋白進行水解，采用成本低廉的D201陰離子交換樹脂對酶解物進行一次分離，獲得酪蛋白多肽；系統分析酪蛋白多肽的抗氧化性，旨在為酪蛋白抗氧化肽的產業化開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荷斯坦牛乳：甘肅農業大學牛奶廠；D201樹脂：上海匯珠樹脂有限公司；透析袋（0.1 kDa）：上海源葉生物科技有限公司；胰蛋白酶（2 500 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；賴氨酸：天津市光復精細化工研究所；大豆卵磷脂：鄭州萬博食品配料有限公司；鹽酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：天津醫藥化學有限公司；鄰苯二甲醛（phthalaldehyde，OPA）：天津市光復科技發展有限公司；四硼酸鈉、β-巰基乙醇、1,1-二苯基-2-苦基苯基（1,1-diphenyl-2-bitter phenylyl，DPPH）：天津市凱信化學工業有限公司；無水乙醇、氯化亞鐵、三氯化鐵、三氯乙酸、鐵氰化鉀、菲洛嗪、抗壞血酸、2-硫代巴比妥酸、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉：國藥集團化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

3K-15高速冷凍離心機：德國Sigma公司；JJ224BC型電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；PHS-3C pH計：上海三信儀器廠；DF-II恒溫水浴磁力攪拌器：金壇市順華儀器有限公司；TDL80-2B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；FD-IA-50冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酪蛋白的提取

將新鮮荷斯坦牛乳在高速冷凍離心機中4℃、6000 r/min離心15 min，棄去上層脂肪，取其下清液逐滴加入1 mol/L的HCl，并且緩慢攪拌使其沉降，靜置4 h后用紗布過濾，用蒸餾水洗滌沉淀4次，即得鹽酸沉淀酪蛋白；將其置于冷凍干燥機中干燥48 h。將干燥好的酪蛋白粉碎，冷藏備用。

1.3.2 酪蛋白的水解

準確稱取10.0 g酪蛋白，加入300 mL蒸餾水溶解，45 ℃加熱磁力攪拌，溶解過程中加1 mol/L NaOH調節pH值始終控制在7.0左右，直至酪蛋白溶解后用蒸餾水定容至500 mL。向酪蛋白溶液中加入400 μL質量濃度為0.1 g/mL的胰蛋白酶，在pH 7.0的條件下恒溫水浴37 ℃磁力攪拌3 h，酶解結束后在沸水浴中5 min滅酶活，冷水中迅速冷卻。

1.3.3 酪蛋白水解度的測定

賴氨酸標準曲線的繪制：準確稱取40 mg OPA溶于1.00 mL體積分數95%的乙醇溶液中，移取pH 9.5的0.1 mol/L四硼酸鈉緩沖溶25.00 mL、SDS溶液（20 mg/100 mL）2.50 mL、β-巰基乙醇100 μL混合均勻，用蒸餾水定容至50 mL。稱取賴氨酸0.050 0 g，用蒸餾水定容至100 mL，配成質量濃度為500 μg/mL的溶液。分別移取適量賴氨酸溶液，稀釋至400 μg/mL、300 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL。取上述賴氨酸溶液400 μL，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）稀釋至7.5 mL；取上述溶液200 μL，加入6.00 mL OPA試劑，混合均勻后室溫條件下暗室放置5 min，以200 μL蒸餾水和6.00 mL OPA試劑混合液為參比，測定波長340 nm處的吸光度值；以賴氨酸質量濃度（x）作為橫坐標，吸光度值（y）作為縱坐標，繪制標準曲線。

水解度的測定：取400 μL酪蛋白酶解液或未加酶的酪蛋白溶液，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）稀釋至7.5 mL；取200 μL上述酶解液，加入6.00 mL OPA試劑，混合均勻后室溫條件下暗室放置5 min，以200 μL蒸餾水和6.00 mL OPA試劑混合液為參比，測樣品在波長340 nm處的吸光度值。酪蛋白水解度計算公式[18]如下：

式中：A0為未加酶樣品的吸光度值；A為酶解后樣品的吸光度值。

1.3.4 酪蛋白多肽的分離

離子交換樹脂的預處理：稱取200 g D201樹脂置于燒杯中，倒入飽和食鹽水，使飽和食鹽水完全浸沒樹脂，并不斷攪拌以除去氣泡，使之充分混合，靜置24 h。

將泡好的樹脂裝入分離柱中，用2倍柱體積的飽和食鹽水緩慢沖洗樹脂，然后用蒸餾水洗至無黃色液體流出。

用5倍柱體積4%的NaOH溶液浸泡，再用蒸餾水沖洗至中性；用5倍柱體積4%的HCl浸泡，再用蒸餾水沖洗至中性。

多肽的分離：在室溫條件下，將水解后的酪蛋白溶液160 mL流過D201陰離子交換樹脂層析柱，采用氯化鈉梯度洗脫，氯化鈉濃度為0～3%，洗脫液總體積為2 000 mL，分管收集分離出的液體，每管收集15 mL，洗脫液用紫外-可見分光光度計在波長280 nm處測定吸光度值。以洗脫液體積為橫坐標，洗脫液吸光度值為縱坐標繪制洗脫曲線。

根據洗脫曲線，合并同一洗脫峰，置于透析袋（截留分子質量0.1 kDa）中透析24 h，采用冷凍干燥機凍干，即得酪蛋白多肽。

1.3.5 抗氧化性測定

還原力的測定：參考GU F等[19]的方法，準確稱取適量酪蛋白肽，用蒸餾水配制成質量濃度為1.0 mg/mL的溶液，取多肽溶液1 mL，與1.0 mL濃度為0.2 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和1.0 mL 1%的鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]混合。將反應混合物在50 ℃水浴中溫育20 min，冷卻至室溫后加入1.0 mL的10%三氯乙酸。使用離心機在25 ℃條件下將混合物4 000 r/min離心10 min。取離心后的上清液2.0 mL，加入2.0 mL蒸餾水和400 μL 0.1%FeCl3。使用紫外-可見分光光度計在波長700 nm處測量反應混合物的吸光度值。還原力表示為波長700 nm處的吸光度值，以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）作為抗氧化劑參照物比較還原力。

DPPH自由基清除活力的測定：參考BENJAKUL S等[20]的方法，將2.0 mL質量濃度為1.0 mg/mL的多肽溶液加入4.0 mL DPPH濃度為0.1 mmol/L的乙醇溶液，將溶液劇烈混合，并在室溫條件下于黑暗中靜置20 min。將混合物4 000 r/min離心10 min。使用紫外-可見分光光度計在波長517 nm處測量上清液的吸光度值，記為A1；用等體積乙醇溶液替代DPPH溶液，吸光度值記為A2，等體積水代替樣品溶液，吸光度值記為A0；等體積水和乙醇混合溶液調零。DPPH自由基清除力計算公式如下：

Fe2+螯合力的測定：將2.0 mL質量濃度為1.0 mg/mL的多肽溶液與3.7 mL蒸餾水和0.1 mL濃度為2.0 mmol/L的FeCl2混合，將混合物在室溫條件下靜置30 s；加入0.2 mL濃度為5 mmol/L菲洛嗪并混合，在室溫條件下靜置10 min，4 000 r/min離心5 min；用紫外-可見分光光度計測定波長562 nm處的吸光度值，記為A1。用水代替樣品作為空白，以相同的方式進行測定，記為A2。Fe2+螯合力計算公式[21]如下：

脂質過氧化抑制力的測定：參考YI O S等[22]的方法，將卵磷脂懸浮于質量濃度為10.0 mg/mL的磷酸鹽緩沖液（0.01 mmol/L，pH 7.4）中，溶液標記為LLS。將15 g三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、0.37 g硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）和2 mL濃HCl加入蒸餾水中，將體積調節至100 mL，標記為TCA-TBA-HCl。將1 mL LLS、1.0 mL 400 μmol/L FeCl3、1.0 mL 400 μmol/L抗壞血酸和1.0 mL樣品溶液依次混合。將溶液在37 ℃黑暗的水浴中放置60 min，再加入2.0 mL TCA-TBA-HCl。混合液在90～100 ℃水浴加熱15 min后用冰水冷卻。將溶液以750 r/min離心10 min，采用紫外-可見分光光度計于波長532 nm處測定上清液的吸光度值，記為As。用1.0 mL蒸餾水替代樣品，吸光度值記為Ac。脂質過氧化抑制力計算公式如下：

1.3.6 數據處理

各組數據均為3次實驗的平均值±標準偏差，采用SPSS 18.0（SPSS Inc.，USA）進行顯著性分析，采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 酪蛋白水解度

賴氨酸標準曲線如圖1所示。

圖1 賴氨酸標準曲線Fig.1 Standard curve of lysine

由圖1可知，經線性擬合，得到賴氨酸標準曲線方程為y=0.001 01x+0.039 78，方程相關系數R2為0.999 8，可以滿足實驗要求。經標準曲線方程計算得知，酪蛋白的水解程度為（83.33±3.26）%，由此可見，酪蛋白的水解程度較高。

2.2 酪蛋白多肽的分離

酪蛋白的胰蛋白酶水解液經過D201陰離子交換樹脂分離的洗脫曲線見圖2。

圖2 酪蛋白酶解液洗脫曲線Fig.2 Elution curve of casein enzymatic hydrolysate

由圖2可知，采用D201陰離子交換樹脂對酪蛋白酶解液分離后得到5個峰（分別標記為P1、P2、P3、P4、P5），實現了很好的分離。

2.3 酪蛋白多肽的抗氧化性

2.3.1 還原力

還原力是衡量多肽抗氧化性的重要指標之一，評價的是多肽的給電子能力。據報道，甲硫氨酸殘基的硫原子可供電子，因而具有較強的還原力；甘氨酸的側鏈有一個氫原子，使多肽具有很好的構象柔性，而脯氨酸的吡咯烷環可以阻止多肽的α-螺旋結構生成，這些氨基酸的存在有利于多肽中其他氨基酸殘基抗氧化性的發揮[23-26]。對分離獲得的5種酪蛋白多肽和未分離的酪蛋白酶解液進行還原力測定，結果見圖3。

圖3 酪蛋白酶解液及多肽的還原力Fig.3 Reducing powers of casein enzymatic hydrolysate and polypeptide

由圖3可以看出，酪蛋白酶解液的還原力最低，其吸光度值為0.026。酪蛋白多肽P2的還原力最大，其吸光度值為0.231。酪蛋白多肽的還原力順序為P2＞P1＞P4＞P5＞P3，且多肽間還原力差異顯著（P＜0.05）。由此可見，經過分離后，還原力較高的肽段得以富集。

2.3.2 DPPH自由基清除力

對分離獲得的5種酪蛋白多肽和未分離的酶解液進行DPPH自由基清除力測定，結果見圖4。

圖4 酪蛋白酶解液及多肽的DPPH自由基清除力Fig.4 DPPH radical scavenging activities of casein enzymatic hydrolysate and polypeptide

由圖4可以看出，與未分離的酶解液相比，分離所得的5個肽段DPPH自由基清除活力均高于酶解液。就多肽而言，多肽P4的DPPH自由基清除活性最強達到（23.8±0.18）%，P3的清除活性最差為（4.5±0.16）%；多肽P4與P2的DPPH自由基清除活性相當，均高于多肽P1。DPPH法測定多肽抗氧化性是基于單電子轉移機理，可用于評價多肽提供電子的能力[15-16]。多肽P3的DPPH自由基清除活性是5個多肽中最差的，這一結果與還原力測定結果一致。雖然多肽P4、P5的還原力低于其他肽段，但其自由基清除活性并不低于其他肽段，這是因為多肽的自由基清除活性較還原力而言受到的影響因素更多、更為復雜，如pH、分子質量等[27-28]。

2.3.3 Fe2+螯合能力

對分離獲得的5種酪蛋白多肽進行Fe2+螯合能力的測定，以未分離的酪蛋白酶解液為對照，結果見圖5。

圖5 酪蛋白酶解液及多肽的Fe2+螯合率Fig.5 Fe2+chelating activities of casein enzymatic hydrolysate and polypeptide

由圖5可以看出，未分離的酶解液Fe2+螯合率為（31.27±5.80）%。多肽P3的螯合率為（2.50±0.14）%，基本可忽略。其他4個肽段的Fe2+螯合率均＞90%，其中多肽P5的Fe2+螯合率達（99.80±0.12）%，表現出極好的金屬螯合能力。

據報道，組氨酸的咪唑基團可以螯合金屬離子；酸性氨基酸（如谷氨酸、天門冬氨酸）帶負電的側鏈具有較好的金屬螯合能力；堿性氨基酸賴氨酸也具有金屬螯合能力[23-27]。采用陰離子交換樹脂分離多肽的機理基于帶負電荷的肽段被吸附于樹脂上，在用鹽洗脫的過程中，Cl-將多肽交換下來，從而實現了分離。由此可見，分離所得的肽段中性條件下帶有負電荷，酸性氨基酸含量較高，從而表現出極高的金屬螯合能力。肽段P3可能在金屬螯合力測定條件下發生自組裝，形成多聚體，或因其分子質量及構象影響，基本沒有金屬螯合能力，具體原因有待進一步研究。

2.3.4 脂質過氧化抑制力

對分離獲得的5種酪蛋白多肽進行脂質過氧化抑制力的測定，以未分離的酪蛋白酶解液為對照，結果見圖6。

由圖6可以看出，酪蛋白酶解液表現出一定的脂質過氧化抑制力，抑制率為（14.82±0.12）%，而分離所得的肽段P1和P4抑制力較差，多肽P2和P3不具備脂質過氧化抑制能力；多肽P5的抑制力為（13.58±0.38）%。總而言之，多肽的脂質過氧化抑制力低于酶解液。

圖6 酪蛋白酶解液及多肽的脂質過氧化抑制力Fig.6 Lipid peroxidation inhibition of casein enzymatic hydrolysate and polypeptide

3 結論

利用牛乳酪蛋白為原料，經過胰蛋白酶充分水解后，再通過D201陰離子交換樹脂梯度洗脫分離出5個較顯著的肽片段，其分離效果較好。對酪蛋白酶解液與分離所得的5個肽段分別進行抗氧化性測定，對比還原力和DPPH自由基清除能力發現，分離出的肽段高于酶解液。P1、P2、P4、P5肽段的還原力、DPPH自由基清除活力、Fe2+螯合力均明顯高于P3肽段，其中，P2肽段的還原力最高，為0.234，然后是P3肽段，為0.057；P4肽段的DPPH自由基清除活力最高，達到（23.8±0.18）%，然后是P3肽段，為（4.5±0.16）%；P5肽段的Fe2+螯合力最高，高達（99.80±0.12）%，P3肽段的Fe2+螯合力最低，為（2.50±0.14）%，而酶解液的Fe2+螯合率為（31.27±5.80）%。酶解液的脂質過氧化抑制力高于多肽；P5肽段的脂質過氧化抑制力為（13.58±0.38）%，略低于酶解液，酶解液的抑制力是（14.82±0.12）%，而P2、P3肽段不具備脂質過氧化抑制力。綜上所述，酪蛋白多肽P1、P4、P5具有較好的抗氧化性。