混合型苦瓜保健酒的發酵工藝優化及其抗氧化活性研究

那廣寧，徐銘悅，鄭詩綺，李云躍，汪 琢

（沈陽工學院 生命工程學院，遼寧 撫順 113122）

苦瓜（Momordica charantial）是葫蘆科苦瓜屬一年生攀援狀柔弱草本植物，又名涼瓜、癩瓜、君子菜、錦荔枝等，廣泛種植于熱帶亞熱帶國家，栽培歷史悠久。可藥食兼用、性味苦寒、清心明目，素有“藥用蔬菜之稱”[1-3]。苦瓜中除了含有豐富蛋白質，脂類和維生素外，還有特殊的化學成分，如凝集素，苦瓜素，苦瓜抑制劑，苦瓜皂苷等[4-5]。保健酒是指對人體具有保健作用的飲料酒，在中國有著悠久的歷史。隨著生活水平的提高，人們對健康越來越重視，保健酒兼具保健及酒類特點，其發展迎來了重大的機遇期，近年來成為了食品飲料行業的研究熱點。

皂苷是存在于自然界中一種天然物質，自然界許多植物里含有皂苷成分。如大豆、桔梗、人參、柴胡、三七、苦瓜、麥門冬、木通、茶葉等均含有皂苷。苦瓜皂苷占苦瓜干物質質量分數的4%，大部分屬于三萜類[6-7]。苦瓜中的三萜皂苷主要包括葫蘆素烷型四環三萜和烏蘇酸型五環三萜[8]。現代研究證實，苦瓜皂苷具有降血糖、抗氧化、抗病毒、降低膽固醇、養血滋肝和抑菌的功效[9-15]。近年來國內外學者對微生物法轉化人參皂苷做了深入的研究。植物乳桿菌對皂苷有較高的轉化效率，可作為釀造功能性酒品的發酵菌種[16]。

該研究以苦瓜汁和果蔬汁為原料釀酒，對其發酵工藝進行優化，篩選出感官評價最好、測定其皂苷含量及酒精度，并研究其抗氧化活性，旨在找出苦瓜酒的保健功能，為苦瓜的深加工及功能性食品的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

苦瓜、金冠蘋果、菠蘿、白砂糖：市售；植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）：武漢欣欣佳麗生物科技有限公司；偏重亞硫酸鉀：上海展云化工有限公司；果膠酶（5萬U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；MRS培養基：青島海博生物技術有限公司。

1.1.2 試劑

人參皂苷Rg1標準品（純度為98.85%）：撫順市食品藥品檢驗所。抗壞血酸、硫酸亞鐵、三氯化鐵、香草醛、冰乙酸、高氯酸、無水乙醇、甲醇、三氯乙酸、鹽酸等均為分析純：廣州化學試劑廠。所有水均為雙蒸水。

1.2 儀器與設備

MC型電子天平：沈陽龍騰電子有限公司；SB25-12DTDN超聲波清洗器：昆山禾創超聲儀器有限公司；RE-52B旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；HH-6數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；TD5A-WS臺式低速離心機：上海盧湘儀宜儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；XPX-9052MBE電熱恒溫培養箱：上海博訊業有限公司醫療設備廠；FD-1E-50冷凍干燥機：上海比朗儀器有限公司；UV-721型可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；DL102電熱鼓風干燥箱：天津市實驗儀器廠；SJ03-250蘇泊爾多功能攪拌機：浙江蘇泊爾股份有限公司；FA1004電子分析天平：上海民橋精密科技儀器有限公司；0-40度酒精計：康華儀器儀表廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 苦瓜保健酒釀造工藝流程

新鮮水果→去皮去核→切塊榨汁→加偏重亞硫酸鉀→加果膠酶→靜置24 h→取上清液→與苦瓜汁混合→活化菌種→加菌種→加糖→主發酵→倒灌→后發酵→下膠→成品

1.3.2 操作要點

原料挑選：選取成熟度適宜、表皮完好的新鮮水果及肉質厚、成熟度適中、外皮青綠色、無病斑、無機械傷的苦瓜，剔除質量不佳的原料。

破碎榨汁：蘋果去核，菠蘿去皮，切成小塊分別用榨汁機榨碎后果汁以1∶1混勻。

添加試劑：為防止蘋果氧化應迅速灌裝或在榨汁過程中按100 L加入12～20 g偏重亞硫酸鉀，再添加質量分數為0.04%的果膠酶以保證出汁率與澄清度，靜置24 h使果膠酶充分作用于原液。加糖時，用果汁溶解后再將其均勻撒入發酵液中，以保證發酵體系中糖濃度的均衡。

苦瓜汁的制作：將苦瓜清洗，剖分去籽，再將苦瓜破碎成1 cm3左右的瓜丁，于沸水中漂燙2 min，立即冷卻，瀝干，打漿。漿液中添加0.02‰的Na2SO3，冷藏備用。

菌種活化：酵母菌用37 ℃果汁活化30 min；植物乳桿菌活化：用無菌吸管吸取1 mL已滅菌的常溫乳酸細菌培養基（MRS）液體，移至菌種管內，輕微充分振蕩，將凍干乳酸菌體溶解成懸浮液狀，取約0.5 mL的菌液MRS固體培養基上，37 ℃靜置培養36 h，連續培養三代后再進行劃線培養，待長出單菌落后，挑選生長旺盛的單菌落。將生長旺盛的單菌落接種到已滅菌的MRS基礎培養基中擴大培養，37 ℃靜置培養36 h，即得菌液，備用[16]。

主發酵與后發酵：將活化好的菌種固定酵母菌添加量為0.1%，混合乳酸菌一起加入發酵液后封閉罐口，于24 ℃環境（波動不大于5 ℃）發酵一周，每日早晚監測溫度。一周后（即主發酵結束）立即倒罐，棄下層沉淀。倒罐后加少量偏重亞硫酸鉀，在10 ℃條件下密封陳釀一個月。

下膠：采用蛋清下膠，用量為每1 000 L果酒20個蛋清。

1.3.3 單因素試驗

（1）果汁與苦瓜汁比例對苦瓜保健酒的影響：固定酵母添加量為1 mL/L，乳酸菌添加量為5 mL/L，發酵溫度為28 ℃，發酵時間為10 d，蘋果菠蘿汁與苦瓜汁比例分別為1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，以酒精度、感官評分及皂苷含量為評價指標對苦瓜保健酒進行綜合評價。

（2）發酵時間對苦瓜保健酒的影響：固定蘋果菠蘿汁與苦瓜汁比例為1∶2，酵母添加量為1 mL/L，乳酸菌添加量5 mL/L，發酵溫度為28 ℃，發酵時間分別為5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d，以酒精度、感官評分及皂苷含量為評價指標對苦瓜保健酒進行綜合評價。

（3）菌種添加量對苦瓜保健酒的影響：固定發酵溫度為28 ℃，發酵時間為10 d，果汁與苦瓜汁比例為1∶2，固定酵母菌添加量為1 mL/L，乳酸菌添加量分別為3 mL/L、4 mL/L、5 mL/L、6 mL/L、7 mL/L、8 mL/L、9 mL/L，以酒精度，感官評分及皂苷含量為評價指標對苦瓜保健酒進行綜合評價。

（4）發酵溫度對苦瓜保健酒的影響：固定果汁與苦瓜汁比例為1∶2，酵母添加量為1 mL/L，乳酸菌添加量為5 mL/L，發酵時間為10 d，發酵溫度分別為17.5 ℃、20 ℃、22.5 ℃、25 ℃、27.5 ℃、30 ℃、32.5 ℃，以酒精度，感官評分及皂苷含量為評價指標對苦瓜保健酒進行綜合評價。

1.3.4 響應面試驗設計

響應面試驗數據采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進行分析處理。以感官評分為響應值，選擇果汁與苦瓜汁比值、發酵時間、菌種添加量和發酵溫度為影響因素，響應面試驗設計因素與水平見表1。

表1 發酵條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization

1.3.5 苦瓜酒皂苷含量的測定方法及標準曲線的繪制

稱取人參皂苷Rg1標準品10 mg加甲醇溶液定容至10 mL之后搖勻，得1 g/L的人參皂苷標準液。準確吸取對照品溶液0、40、80、120、160、200、240 mL于500 mL具塞試管中，在70 ℃水浴揮干溶劑。先加入5%的香草醛-冰乙酸溶液0.4 mL，高氯酸0.6 mL。搖勻，于70 ℃水浴鍋閉口加熱振蕩20 min，取出后用冰水冷卻至0 ℃。加入冰乙酸5 mL稀釋，搖勻，靜置15 min。以甲醇溶液為空白對照，在波長550 nm處測吸光度值。以波長550 nm處測得的吸光度值y為縱坐標，人參皂苷Rg1的取樣量x為橫坐標，繪制出標準曲線，得到標準曲線回歸方程為：y=0.002 8x-0.001 3，相關系數R2=0.994 6。

取適量的苦瓜保健酒置于10 mL的具塞試管中，在水浴中揮干溶劑，以甲醇溶液為空白對照，在可見分光光度計550 nm處測得吸光度值，并按公式（1）計算苦瓜皂苷提取率。

式中：1為人參皂苷標準溶液的質量濃度，g/L；x為從標準曲線得到待測液的取樣量，L；V為定容體積，L；v為實際待測液取樣量，L；M為苦瓜粉質量，g。

1.3.6 酒精度的測定

利用酒精計測定酒精度。

1.3.7 感官評定

感官指標：混合果酒呈嫩綠色，果香與酒香味搭配和諧，芳香醇和，無異味，澄清有光澤，符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的要求。對混合果酒進行感官評定（滿分100分），感官評定標準見表2。

表2 果酒感官評定標準Table 2 Sensory evaluation standards of fruit wine

1.3.8 抗氧化活性的測定

（1）苦瓜保健酒對羥自由基的清除作用

將苦瓜保健酒用蒸餾水配制為質量濃度為0.30 mg/mL、0.60 mg/mL、0.90 mg/mL、1.20 mg/mL、1.50 mg/mL、1.80 mg/mL的樣液，分別吸取1.2 mL樣品溶液于具塞試管中依次加入4 mL 2.5 mmol/L FeSO4溶液，3 mL 1 mmol/L H2O2溶液，輕輕搖勻，再加入4 mL 5 mmol/L水楊酸溶液，在38 ℃水溶鍋中振蕩加熱55 min，取出自然冷卻至室溫，最后測吸光度值A1，同時如上操作，用3 mL蒸餾水代替3 mL H2O2溶液測吸光度值，記錄為A2，用蒸餾水代替樣液作為空白對照，吸光度值為A0，同時以VC作陽性對照。羥自由基清除率計算公式如下：

（2）苦瓜保健酒還原Fe3+能力的測定

將苦瓜保健酒用蒸餾水配制為質量濃度為0.30 mg/mL、0.60mg/mL、0.90mg/mL、1.20mg/mL、1.50mg/mL、1.80 mg/mL的樣液，分別吸取2 mL樣品溶液于具塞試管中，依次加入1.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液和1.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液（K3Fe（CN）6），于50 ℃水浴中保溫20 min后在冰浴中快速冷卻，再加入2 mL10%三氯乙酸溶液，以3 000 r/min的轉速離心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2 mL蒸餾水，0.4 mL 0.1%三氯化鐵，充分混勻，靜置12 min后，在波長700 nm條件下測定其吸光度值（以蒸餾水為參比溶液），同時以VC作為標樣，操作同上。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 混合果汁與苦瓜汁比例對苦瓜保健酒的影響

圖1 混合果汁與苦瓜汁比例對苦瓜酒的影響Fig.1 Effect of the proportion of compound fruit juice to Momordica charantia juice on M.charantia wine

由圖1可知，隨混合果汁比例的增大，苦瓜酒的酒精度增加，在添加比為3∶1時達到最高，是由于蘋果和菠蘿的含糖量高于苦瓜，在發酵時能夠形成更高的酒精度。當混合果汁∶苦瓜汁添加比為1∶5、1∶4、1∶3、1∶2時，酒體的苦味重，果香味較淡。當添加比為2∶1和3∶1時，酒體無苦瓜感官特征，果香味濃。當蘋果菠蘿混合果汁與苦瓜汁添加比為1∶1時，苦瓜酒的感官評分最佳。總皂苷含量隨苦瓜用量的減少呈下降趨勢，當苦瓜汁含量低于50%時皂苷含量明顯下降。因此，蘋果菠蘿混合果汁與苦瓜汁添加比為1∶1時效果最佳，此時感官評分為86分，酒精度為10.8%vol，皂苷含量為2.26%。

2.1.2 發酵時間對苦瓜保健酒的影響

圖2 發酵時間對苦瓜酒的影響Fig.2 Effect of fermentation time on Momordica charantia wine

由圖2可知，隨著發酵時間的延長，酒精度增加后保持平穩，10 d以前變化明顯，10 d后基本趨于穩定，說明發酵已經結束。在發酵時間為5 d時，果香較重，酒香較淡。20 d以后苦瓜酒產生較重酸味，感官評分明顯下降。在發酵10～20 d時，感官評定趨于穩定，10 d時感官評分最佳。總皂苷含量在發酵過程中呈上升趨勢，10 d前較為明顯，10 d后趨于平緩，說明皂苷含量已接近最大值。因此，發酵時間為10 d時效果最佳，此時感官評分為90分，酒精度為11%vol，皂苷含量為2.71%。

2.1.3 乳酸菌添加量對苦瓜保健酒的影響

圖3 乳酸菌添加量對苦瓜保健酒的影響Fig.3 Effect of lactic acid bacteria inoculum on Momordica charantia wine

由圖3可知，隨著發酵的進行釀酒酵母生成的酒精量增多，乳酸菌用量在3～6 mL/L范圍內變化明顯，超過6 mL/L時酒精度趨于穩定，是由于過量的乳酸菌抑制了酵母菌的發酵作用。當乳酸菌添加量為3 mL/L時，酒體的果香和菜香較濃，苦味較重，酒香較淡，當乳酸菌添加量為7～9 mL/L時，乳酸味稍明顯，影響了酒的味道。隨著乳酸菌添加量的增大，總皂苷含量增加，在添加量為3～5 mL/L時變化明顯，超過5 mL/L時皂苷含量變化趨于平穩，說明皂苷積累量已經接近最大值。因此，乳酸菌添加量為6 mL/L時效果最佳，此時感官評分為84分，酒精度為9.5%vol，皂苷含量為2.71%。

2.1.4 發酵溫度對苦瓜保健酒的影響

圖4 發酵溫度對苦瓜酒的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on Momordica charantia wine

由圖4可知，隨著發酵溫度的升高，酒精度逐漸增大，菌種表現出較好的發酵活力。當發酵溫度超過25 ℃時，酒體香氣流失過多，口感不細膩，感官評分呈下降趨勢。當發酵溫度為25 ℃時，感官評分達到最大值，此時酒體色澤飽滿鮮亮，香氣濃郁。隨著溫度的升高，總皂苷含量增加，說明在較高溫度下乳酸菌對皂苷有較高的轉化效率。當發酵溫度為25 ℃時，效果最佳，此時感官評分為92分，酒精度為11.3%vol，皂苷含量為2.62%。

2.2 苦瓜保健酒發酵的響應面試驗優化結果

在單因素試驗的基礎上，按響應面試驗設計方案，果酒發酵結束后分別對酒精度、感官評分及皂苷含量測定，以皂苷含量為評價指標的測定結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 發酵條件優化Box-Behnken試驗設計與結果Table 3 Design and results of Box-Behnken tests for fermentation conditions optimization

續表

利用Design Expert軟件對表3中的響應值進行二元回歸擬合分析，建立回歸方程預測模型：

表4 回歸模型各項方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

由表4可知，二次回歸模型的F=66.20，P＜0.000 1，說明苦瓜保健酒中皂苷含量（Y）與4個因素之間的回歸方程極顯著。失擬項P=0.068 4＞0.05，說明失擬項不顯著。響應面優化擬合出的方程回歸項的模型P＜0.05，有顯著性差異，失擬項（P=0.671 7＞0.05）差異不顯著。

試驗模型的決定性系數R2=0.984 1，說明皂苷得率的結果與預測值結果有良好的一致性，校正決定系數，表示試驗結果有96.92%受試驗因素影響。此外模型的響應值變異系數（coefficient of variation，CV）值為3.99%，說明模型的重現性好，所以此模型可以用于分析和預測苦瓜保健酒中的皂苷含量。同時從表4中還能看出，D、AB、BC、A2、B2、C2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01），AC、AD、BD、CD對結果影響顯著（P＜0.05）。回歸方程各項方差分析中F檢驗可以判斷自變量對因變量的影響，由此，可以看出4個因素對苦瓜保健酒中的皂苷含量的影響大小排列順序為：發酵溫度＞發酵時間＞菌種添加量＞果蔬汁比例。

2.3 三維響應面和等高線分析

以皂苷含量為評價指標，AB、BC的交互作用對苦瓜酒皂苷含量影響的結果見圖5。從圖5（a）可以看出AB曲面圖最陡，二者的相互影響作用最為顯著。隨著發酵時間（B）和果蔬汁比例的增大，皂苷的含量先上增大后基本保持不變，說明苦瓜酒中的皂苷己經趨于最大值。圖5（b）中隨著發酵溫度（B）和菌種添加量（C）的增加，皂苷的含量均呈現先增大，達到最高值時又快速減小的趨勢。說明發酵溫度或菌種添加量過大會對皂苷含量帶來負面影響，推測可能是由于提高溫度也許會破壞苦瓜皂苷之間的糖苷鍵，影響產率，而添加菌種過多也許會積累其他中間代謝產物，影響苦瓜保健酒中的皂苷含量。

圖5 各因素交互作用對皂苷含量影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction of each factors on saponins content

2.4 最佳工藝條件的預測與檢驗

通過軟件對所建立的模型進行分析，預測釀造苦瓜保健果酒的最優工藝條件為混合果汁∶苦瓜汁=1.5∶1，發酵時間為10 d，菌種添加量6.06 mL/L，發酵溫度為26.18 ℃。此條件下釀得的果酒皂苷含量可高達2.81%。考慮到實際操作的可行性，在蘋果菠蘿混合果汁∶苦瓜汁=1.5∶1，發酵時間為10 d，菌種添加量6 mL/L，發酵溫度為26 ℃的條件下進行5次平行性試驗，所測得的皂苷含量平均值為2.78%，與理論預測值相差極小，說明試驗中的回歸方程適合于苦瓜保健酒釀造工藝的預測與分析。

2.5 苦瓜保健酒的抗氧化活性研究

2.5.1 產品清除羥自由基的能力

通過對苦瓜保健酒和VC進行不同程度的稀釋，測定其羥自由基清除率，結果見圖6。由圖6可知，隨著苦瓜皂苷質量濃度的增加，對·OH清除能力也隨增強。雖然清除率略低于VC，但其增強趨勢與VC相似，對羥自由基的清除率與皂苷的質量濃度成正相關，表明苦瓜保健酒對·OH有一定的清除能力。

圖6 苦瓜保健酒清除羥自由基能力Fig.6 Scavenging ability of Momordica charantia health wine on hydroxyl free radicals

2.5.2 產品還原Fe3+能力的測定

苦瓜保健酒和VC對Fe3+的還原能力結果見圖7。由圖7可知，隨著質量濃度的增加，吸光度值逐漸升高，所表現的還原能力越強。在0.03～0.18 g/L質量濃度范圍內，皂苷的吸光度值與質量濃度成正相關，相關系數為0.969 9，相關性極顯著。說明苦瓜皂苷為良好的電子供應者，可參與自由基反應。但與VC相比，皂苷還原能力較弱。

圖7 苦瓜保健酒還原Fe3+能力Fig.7 Reduction capacity of Momordica charantia health wine on Fe3+

3 結論

本研究在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析法優化發酵工藝條件，結果表明，苦瓜保健酒的最佳發酵工藝條件為混合果汁∶苦瓜汁=1.5∶1、發酵時間10 d、酵母添加量為1 mL/L、乳酸菌添加量6 mL/L、發酵溫度26 ℃，在此條件下成品果酒的顏色呈亮嫩綠色，酒體澄清，果香協調，香氣宜人，皂苷含量高達2.78%，酒精度為11.2%vol，感官評分達到90分。以VC作為陽性對照，采用清除羥自由基和還原Fe3+的能力分析苦瓜保健酒的抗氧化活性，結果表明，苦瓜酒有一定的抗氧化活性，并且與皂苷質量濃度呈正相關。