不同陳釀期松針酵素生物活性變化規(guī)律研究

李 彥，周文化 *，羅奡劼，陳嘉琳，陳露茜，劉裕龍，譚越兮

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 特醫(yī)食品加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；3.湖南恩松生物科技有限公司，湖南 湘潭 411100）

松針（Pinus armandiFranch）為松科（Pinaceae）松屬（Pinus）植物的葉，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生理活性成分，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、抗突變、降血脂、降血壓、抗衰老、消炎抑菌等[1]作用。松針在我國(guó)分布廣泛，價(jià)格低廉，將松針資源進(jìn)行深度開(kāi)發(fā)和利用具有重要的意義。

酵素食品是指以一種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、藥食同源中草藥等為原料，經(jīng)多種有益菌發(fā)酵而成的功能性產(chǎn)品，含有豐富的酶、維生素、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等營(yíng)養(yǎng)成分[2]，具有抗氧化[3]、美白[4]、增強(qiáng)免疫力[5]及改善肥胖[6]的功效。近年來(lái)，關(guān)于酵素酶系及抗氧化活性研究較多，如張夢(mèng)梅等[7]檢測(cè)了市售酵素的酶系；趙光遠(yuǎn)等[8]研究了紅棗酵素在發(fā)酵過(guò)程中的活性酶系及相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律；王輝等[9]研究了青梅酵素的抗氧化活性、活性酶系及抑菌效果等，這些報(bào)道集中在某種酵素的活性物質(zhì)的檢測(cè)或是發(fā)酵過(guò)程中活性物質(zhì)的變化研究，關(guān)于酵素陳釀期間生物活性的變化研究鮮有報(bào)道。

本研究以不同陳釀期的松針酵素為研究對(duì)象，采用國(guó)標(biāo)中的方法及試劑盒準(zhǔn)確測(cè)定松針酵素中的活性酶系，并以還原力、超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力、羥基自由基（·OH）清除能力、1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）自由基清除能力為抗氧化性指標(biāo)對(duì)松針酵素的抗氧化性能進(jìn)行檢測(cè)分析。以期探討松針酵素陳釀過(guò)程中活性酶系及抗氧化活性的變化規(guī)律，科學(xué)評(píng)價(jià)松針酵素的抗氧化活性及其品質(zhì)，為評(píng)估松針酵素的功能及產(chǎn)品質(zhì)量的改善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

松針、松花粉、松子、沙棘、柚子、胡蘿卜、菊花、檸檬、橘子、玫瑰花、桂花：湖南恩松生物科技有限公司；安琪牌葡萄酒用高活性干酵母、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）CECT5716、短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）M-16V：中科院微生物研究所。

1.1.2 試劑

DPPH、乙醇、ABTS、過(guò)硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、Tris、鄰苯三酚、淀粉酶試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、鹽酸、酪蛋白、酪氨酸、福林酚、碳酸鈉、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、聚乙烯醇、橄欖油、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、乙酸、乙酸鈉、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉、無(wú)水硫酸鈉、酒石酸鈉、苯酚、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YP-B10001分析天平：上海光正醫(yī)療儀器有限公司；BlueStar B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；PHSJ-3FpH計(jì)：上海圣科儀器設(shè)備有限公司；TG16MW臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；84-1磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；FA25-D剪切機(jī)：上海弗魯克科技發(fā)展公司；BET-40生化培養(yǎng)箱：天津天大天發(fā)科技有限公司；SpectraMa酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Device公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 松針酵素制備工藝流程及操作要點(diǎn)

原料→清洗→熱燙、瀝干→研磨→酵母發(fā)酵→混合發(fā)酵→后熟→松針酵素

操作要點(diǎn)：選取松針、松花粉、松子等原料，用清水洗滌后熱燙15 min，冷卻瀝干后加水研磨得到混合果漿，加入22%紅糖和33%冰糖，溶解均勻，再加入0.8%活化后的干酵母，置于22 ℃條件下發(fā)酵18 d，再接種6%短雙岐桿菌M-16V和發(fā)酵乳桿菌CECT5716的混合菌液（短雙岐桿菌M-16V∶發(fā)酵乳桿菌CECT5716=1.0∶1.5），混合發(fā)酵結(jié)束后即得松針酵素成品。松針酵素于4 ℃低溫陳釀，分別取陳釀半年、一年、兩年、三年、四年的松針酵素，4 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，取上清液測(cè)定各指標(biāo)。

1.3.2 活性酶的測(cè)定

蛋白酶：參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》，以酪氨酸的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.174 8x-0.055 6（R2=0.999 1）計(jì)算樣品中酪氨酸的含量。蛋白酶活力定義：在40 ℃條件下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生l μg酪氨酸定義為1個(gè)蛋白酶活力單位（U）。

纖維素酶：參照NY/T 912—2004《纖維素酶活力的測(cè)定-分光光度計(jì)法》，以葡萄糖的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.907 3x+0.085 5（R2=0.999 6）計(jì)算樣品中纖維素酶水解羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生的還原糖含量，再根據(jù)公式換算成樣品中纖維素酶的含量。纖維素酶活力定義：在37℃、pH值為5.5的條件下，每分鐘從質(zhì)量濃度為4 mg/mL的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

脂肪酶：參照GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》中的電位滴定法測(cè)定。脂肪酶活力定義：1 g固體酶粉（或1 mL液體酶），在一定溫度和pH值條件下，1 min水解底物產(chǎn)生1 mol可滴定的脂肪酸即為1個(gè)酶活力單位（U）。

淀粉酶：參考淀粉酶試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)測(cè)定。淀粉酶活力定義：在60 ℃、pH值6.0的條件下，1 h液化1 g可溶性淀粉所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

SOD：參考SOD試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)測(cè)定。SOD活力定義：25 ℃時(shí)抑制鄰苯三酚自氧化速率50%時(shí)所需的SOD量為一個(gè)活力單位（U）。

1.3.3 抗氧化能力的測(cè)定

DPPH自由基清除能力的測(cè)定參考SHARMA O P等[10]的方法；ABTS自由基清除能力的測(cè)定參照MUSTAFA O等[11]的方法；羥基自由基清除能力的測(cè)定參照SHUANG L X等[12]的方法；超氧自由基清除能力的測(cè)定參照DU G等[13]的方法；還原力的測(cè)定參考SABOKBAR N等[14]的方法。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

在Excel 2013中對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。采用OriginPro8.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 松針酵素陳釀期間活性酶的變化

酵母菌發(fā)酵混合果漿不但保留了原材料中的營(yíng)養(yǎng)成分，而且通過(guò)微生物的代謝產(chǎn)生了新的活性酶，賦予了松針酵素極強(qiáng)的保健功能，這些活性酶主要包括SOD、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶。SOD是一種特殊的金屬酶，能有效清除機(jī)體內(nèi)的的超氧陰離子自由基，對(duì)生物體來(lái)說(shuō)是一道保護(hù)屏障，且具有抗氧化、防衰老、抗輻射等多種功效，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[15]；蛋白酶不僅能促進(jìn)蛋白質(zhì)的水解，還能分解瀕臨凋亡的細(xì)胞，具有促消化和美容的功效[16]；脂肪酶是一類水解油脂的酶類，主要作用于油脂中的脂肪酸和甘油相連接的酯鍵，水解底物一般為天然油脂，廣泛應(yīng)用于減肥產(chǎn)品及保健品中[17]；淀粉酶能夠催化淀粉水解，具有促進(jìn)人體消化的功能；纖維素酶能夠?qū)⒗w維素分解為葡萄糖，改善人體的消化系統(tǒng)。松針酵素陳釀期間活性酶活力的變化見(jiàn)圖1。

圖1 松針酵素陳釀期間活性酶活力的變化Fig.1 Changes of active enzyme activities in pine needle Jiaosu during aging periods

由圖1可知，在松針酵素中存在SOD、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶，且5種酶活性均隨陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。與之前研究相符，不同陳釀期松針酵素的蛋白質(zhì)含量隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)而降低[18]。陳釀初期，蛋白酶活力和SOD活力較高，分別為427.66 U/mL、258.67 U/mL；淀粉酶、纖維素酶以及脂肪酶活力較低，分別為12.95 U/mL、6.92 U/mL和1.90 U/mL。陳釀末期，蛋白酶活力最高，其次是SOD、纖維素酶和淀粉酶，脂肪酶活力最低，分別為241.54 U/mL、163.51 U/mL、4.98 U/mL、1.52 U/mL、0.33 U/mL。在整個(gè)陳釀期間，淀粉酶和脂肪酶活力下降最多，分別下降88.26%和82.63%；蛋白酶、SOD、纖維素酶活力分別下降43.52%、36.79%、28.03%。

董銀卯等[3]使用酵母菌發(fā)酵制備火龍果酵素，測(cè)得其SOD、淀粉酶和脂肪酶活力分別為300 U/mL、33.2 U/mL、1.8 U/mL；周偏等[19]研究發(fā)現(xiàn)，諾麗酵素活性較高，其中SOD活性和淀粉酶活性分別達(dá)到376.43U/mL和17.65U/mL；崔國(guó)庭等[20]研究發(fā)現(xiàn)，草莓酵素的SOD活力為35.4 U/mL，淀粉酶活力為3.26 U/mL；邵穎等[21]考察了植物酵素發(fā)酵過(guò)程中SOD、纖維素酶、蛋白酶等幾種酶活性的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，SOD活力為（49.29±2.02）U/mL、纖維素酶活力為（319.71±8.19）U/mL、蛋白酶活力為（12.51±1.31）U/mL。與火龍果酵素相比，松針酵素中的SOD、淀粉酶活力略低，但脂肪酶活力相差不大；與諾麗酵素相比，SOD及淀粉酶活性較弱；松針酵素中的SOD及蛋白酶活性高于植物酵素，但纖維素酶活性卻低于植物酵素；草莓酵素中的SOD及淀粉酶活性遠(yuǎn)不及松針酵素。各個(gè)酵素中酶活力出現(xiàn)不同的原因，可能是由于酵素生產(chǎn)工藝的不同，如高溫殺菌致使酵素中的酶失活；也有可能是原料種類及比例的不同，在未發(fā)酵之前，原料本身含有的活性物質(zhì)會(huì)有很大的差異；還有可能是菌種的選擇、發(fā)酵方式、發(fā)酵時(shí)間的不同引起的。

2.2 松針酵素陳釀期間抗氧化能力的變化趨勢(shì)

松針酵素經(jīng)酵母發(fā)酵、短雙歧桿菌和發(fā)酵乳桿菌混合發(fā)酵后得到具有較高活性物質(zhì)以及活性酶的松針發(fā)酵液，這些功能活性成分會(huì)增加松針發(fā)酵液的體外抗氧化活性，通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中各類抗氧化活性指標(biāo)（還原力、ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力及羥基自由基清除能力）的檢測(cè)，從而判斷松針酵素在陳釀期抗氧化活性的變化趨勢(shì)。

2.2.1 松針酵素陳釀期間還原力的變化趨勢(shì)

圖2 松針酵素陳釀期間還原力的變化趨勢(shì)Fig.2 Change of reducing power of pine needle Jiaosu during aging periods

由圖2可知，隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，松針酵素還原力逐漸減小，還原力由最初的0.54下降至0.39，下降27.78%，說(shuō)明陳釀會(huì)導(dǎo)致松針酵素還原能力減弱。分析原因可能是陳釀期間發(fā)酵體系中各分子進(jìn)行氧化還原、酯化、縮合、聚合等一系列反應(yīng)，導(dǎo)致還原能力減弱。

2.2.2 松針酵素陳釀期間超氧陰離子自由基清除率的變化趨勢(shì)

圖3 松針酵素陳釀期間超氧陰離子自由基清除率的變化趨勢(shì)Fig.3 Change of superoxide anion radical scavenging rate of pine needle Jiaosu during aging periods

由圖3可知，陳釀半年的松針酵素對(duì)超氧陰離子自由基清除能力高達(dá)92.93%，隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)稍有下降的趨勢(shì)，總體下降6.9%。分析原因可能與陳釀期間SOD活力不斷下降有關(guān)，ZYRACKA E等[15]研究表明，SOD能催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，從而達(dá)到清除超氧陰離子自由基的目的；另一方面可能是因?yàn)殛愥勂陂g發(fā)酵液體系中活性物質(zhì)持續(xù)下降。

2.2.3 松針酵素陳釀期間羥基自由基清除率的變化趨勢(shì)

圖4 松針酵素陳釀期間羥基自由基清除率的變化趨勢(shì)Fig.4 Change of hydroxyl radical scavenging rate of pine needle Jiaosu during aging periods

由圖4可知，陳釀半年的松針酵素對(duì)羥基自由基清除能力最高達(dá)60.57%，但隨著陳釀期的延長(zhǎng)羥基自由基清除能力不斷減弱，陳釀第4年羥基自由基清除率只有31.77%，總體下降28.8%。其原因可能是陳釀期間松針酵素中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷下降，發(fā)酵菌的生長(zhǎng)繁殖受到抑制，產(chǎn)生可以清除羥基自由基的抗氧化酶類也隨之減少；也有文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)酵菌本身就具備抗氧化能力，如酵母菌的細(xì)胞多糖能有效清除羥基自由基[22]。LEE J等[23]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物能有效清除羥基和超氧陰離子自由基，與金屬形成復(fù)合物，并抑制金屬引發(fā)的脂質(zhì)氧化。因此，松針酵素對(duì)羥基自由基清除能力與發(fā)酵菌、抗氧化酶類以及黃酮類化合物有關(guān)。

2.2.4 松針酵素陳釀期間DPPH自由基清除率的變化趨勢(shì)

圖5 松針酵素陳釀期間DPPH自由基清除率的變化趨勢(shì)Fig.5 Change of DPPH radical scavenging rate of pine needle Jiaosu during aging periods

由圖5可知，松針酵素的DPPH自由基清除能力隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高后略下降的趨勢(shì)。韋仕靜等[24-25]研究發(fā)現(xiàn)，酚類物質(zhì)含量與DPPH自由基清除率呈一定的相關(guān)性；SHAHIDI F等[25]研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)酸、維生素和具有自由羥基的酚類物質(zhì)都可以有效清除自由基。因此，松針酵素對(duì)DPPH自由基的清除能力不僅與發(fā)酵液體系中的多酚物質(zhì)有關(guān)，還與有機(jī)酸、維生素等其他活性物質(zhì)相關(guān)。

2.2.5 松針酵素陳釀期間ABTS自由基清除率的變化趨勢(shì)

圖6 松針酵素陳釀期間ABTS自由基清除率的變化趨勢(shì)Fig.6 Change of ABTS radical scavenging rate of pine needle Jiaosu during aging periods

由圖6可知，松針酵素對(duì)ABTS自由基清除率高達(dá)98.91%，且在陳釀期間，變化較小，說(shuō)明不同陳釀時(shí)間松針酵素發(fā)酵液均表現(xiàn)出很強(qiáng)的ABTS自由基清除能力，且對(duì)ABTS的清除能力非常穩(wěn)定。孫淑夷[26]研究發(fā)現(xiàn)，荔枝汁酵素在發(fā)酵16 h后ABTS自由基清除率高達(dá)98%，發(fā)酵16 h后ABTS自由基清除率較為穩(wěn)定；陳小偉等[27]研究發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)酵時(shí)間諾麗酵素對(duì)ABTS自由基的清除率差異不大。因此，松針酵素不僅對(duì)ABTS自由基的清除率高，且能在一定時(shí)間范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。

綜上，松針酵素的抗氧化活性隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，但對(duì)DPPH自由基的清除率稍有增加。

2.3 松針酵素陳釀過(guò)程中活性酶和抗氧化能力的相關(guān)性分析

采用Pearson法對(duì)松針酵素陳釀過(guò)程中脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、SOD和纖維素酶與DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力、羥基自由基清除能力和總還原力能力的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，DPPH、超氧陰離子自由基清除能力與羥基自由基清除能力、淀粉酶活力及蛋白酶活力呈顯著相關(guān)（P＜0.05），DPPH自由基清除能力與纖維素酶活力呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），超氧陰離子自由基清除能力與還原力呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），與SOD活力呈顯著相關(guān)（P＜0.05）；羥基自由基清除能力除與ABTS自由基清除能力無(wú)顯著相關(guān)外（P＞0.05），與其他指標(biāo)都相關(guān)，其中與還原力、淀粉酶活力及SOD活力呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）；還原力與SOD活力呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）；脂肪酶活力與淀粉酶活力、蛋白酶活力呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）；淀粉酶與蛋白酶活力呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）；ABTS與各指標(biāo)無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。5種活性酶活力與5個(gè)抗氧化指標(biāo)具有一定的相關(guān)性，可以通過(guò)測(cè)定松針酵素中的活性酶含量來(lái)表征其抗氧化特性。

表1 松針酵素中活性酶和抗氧化能力的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of active enzymes and antioxidant ability in pine needle Jiaosu

3 結(jié)論

不同陳釀期松針酵素中含有豐富的活性酶類，包括SOD、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶，在陳釀初期，5種酶活力最高，分別為258.67 U/mL、12.95 U/mL、427.66 U/mL、1.90 U/mL、6.92 U/mL；但隨陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，5種活性酶活力均逐漸降低，酶活力分別下降36.79%、88.26%、43.52%、82.63%、28.03%。

不同陳釀期松針酵素具有良好的抗氧化能力，在整個(gè)陳釀期間，對(duì)超氧陰離子自由基清除能力和ABTS自由基清除能力均＞85%，相對(duì)穩(wěn)定。隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，還原力和羥基自由基清除能力減弱，而DPPH自由基清除能力增加。

松針酵素活性酶與抗氧化性相關(guān)分析結(jié)果表明，5種活性酶活力與5個(gè)抗氧化指標(biāo)具有一定的相關(guān)性，可以通過(guò)測(cè)定松針酵素中的活性酶含量來(lái)表征其抗氧化特性。