MTHFR(C677T)基因T型變異升高Hcy對漢族人群冠脈狹窄程度影響的研究*

陸建忠，張詩吟

(浙江省湖州市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科 313000)

冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化使血管腔阻塞或狹窄，或造成缺氧、心肌缺血而引起的心臟疾病，簡稱冠心病，嚴重威脅人類健康[1]。在冠心病的病因研究中，約有50%患者發(fā)病與吸煙、糖尿病、高血壓、肥胖這些危險因素有關(guān)[2]。研究表明冠心病新的重要危險因素為同型半胱氨酸(Hcy)水平升高[3-4]，Hcy的水平會受到關(guān)鍵酶亞甲基四氫葉酸還原酶的基因多態(tài)性影響[5-6]。因此，預(yù)防冠心病的策略中就包含著降低Hcy水平的方法，而對亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)(C667T)基因多態(tài)性的研究或許能由遺傳學(xué)方面探索冠心病發(fā)生的原因。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年9月至2018年1月至本院心內(nèi)科住院行冠狀動脈造影的患者，共計700例。其中冠狀動脈造影證實冠狀動脈無明顯病變的244例，設(shè)為健康對照組；左主干存在30%以上狹窄病變或冠狀動脈右冠、左前降支、回旋支存在50%以上狹窄病變患者共計456例，設(shè)為冠心病組。納入標準：年齡40～80歲；均為漢族本市常駐居民。排除標準：半年內(nèi)使用過治療冠心病或影響血液Hcy水平的相關(guān)藥物(他汀、氨甲蝶呤、葉酸、維生素)；合并其他嚴重心臟疾病患者；根據(jù)NYHA分級達到Ⅲ、Ⅳ級的心功能或嚴重腎功能不全患者；患者有嚴重的消化、風(fēng)濕免疫、血液、內(nèi)分泌、呼吸等其他系統(tǒng)合并疾病。

1.2 檢測指標 收集研究對象的吸煙情況、年齡、糖尿病病史、性別等。清晨空腹時抽取患者5 mL靜脈血，將抽取的靜脈血其中2 mL置入抗凝管內(nèi)，立即存入冰箱中設(shè)置溫度為-80 ℃，24 h之內(nèi)提取基因組DNA；另外3 mL用于檢測Hcy、血脂、肝功能、腎功能等生化指標。

1.3 基因組DNA提取與MTHER基因多態(tài)性檢測 血液中基因組DNA抽取根據(jù)DNA試劑盒說明書(上海百傲科技有限公司，產(chǎn)品編號BST03021)操作。DNA由核酸蛋白儀(Nanodrop2000)檢測提取，DNA樣本保存?zhèn)溆?保存溫度設(shè)定-80 ℃)。設(shè)計MTHER(C677T)基因片段的PCR引物，見表1。

表1 引物信息

PCR反應(yīng)體系為25 μL，加入含有10 μmol/L的正反引物各0.5 μL和9.5 μL去離子水；12.5 μL PremIxTaq酶、2 μL基因組DNA溶液。95 ℃預(yù)變性3 min，(95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)36個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。對PCR產(chǎn)物純化后采用HinfⅠ限制性核酸內(nèi)切酶進行消化。

1.4 冠狀動脈造影與病變程度評定 擬行冠狀動脈造影檢查的患者術(shù)前均應(yīng)進行碘過敏試驗篩查及使用適當?shù)目寡ㄋ幬镏委煟A(yù)防術(shù)中嚴重不良事件比如血栓形成、造影劑過敏等。本研究經(jīng)橈動脈入路為首選，若橈動脈搏動不夠強則檢測肱動脈，若搏動良好則以肱動脈為入路，若肱動脈搏動亦不強，則為防止外周圍血管閉塞應(yīng)行上肢動脈超聲檢查。入路確定后則先進行局部消毒(5%碘伏進行)，鋪巾之后進行股動脈、肱動脈、橈動脈穿刺(采用SeldInger技術(shù)進行穿刺)，然后放入對應(yīng)型號管，以多體位投照，完成冠狀動脈造影。冠狀動脈造影結(jié)果由兩位經(jīng)驗豐富的臨床醫(yī)師，使用目測法對冠狀動脈病變程度、病變血管支數(shù)、冠狀動脈病變部位進行分析，依據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果，將冠狀動脈病變程度分為3級：A級主要冠狀動脈狹窄程度均小于50%，B級至少一根主要冠狀動脈狹窄程度大于或等于50%且主要冠狀動脈狹窄程度均小于75%無需手術(shù)干預(yù)，C級至少一根主要冠狀動脈狹窄程度大于或等于75%，需要手術(shù)干預(yù)(狹窄程度大于或等于75%，但因血管解剖或其他如嚴重鈣化等因素不適合手術(shù)干預(yù))。

表2 兩組臨床資料的比較

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料的比較 兩組研究對象冠心病組的平均年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；其他一般資料比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.2 MTHFR(C677T)基因多態(tài)性的檢測結(jié)果 通過PCR特異性引物，擴增包含MTHFR(C677T)位點的片段，并對獲得的PCR產(chǎn)物進行體外HinfⅠ限制性核酸內(nèi)切酶消化，其中TT純合型完全酶切后有126、68 bp，TC雜合型完全酶切后有194、126、68 bp，而CC野生型完全酶切后則只有194 bp片段，見圖1。對MTHFR(C677T)基因各基因型患者的年齡、性別進行統(tǒng)計分析，其中TT型患者224例，男132例，女92例；CC型患者163例，男92例，女71例；TC型患者313例，男192例，女121例，3種基因型患者性別分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。3種基因型平均年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

圖1 MTHFR(C677T)基因多態(tài)性的檢測結(jié)果

指標MTHFR(C677T)基因多態(tài)性TTCCTCF/χ2P性別[n(%)] 男 132(58.93)92(56.44)192(61.34)1.1020.577 女92(41.07)71(43.56)121(38.66)年齡(x±s,歲)64.8±7.763.3±7.163.7±8.22.0580.129

2.3 不同基因型患者中血清Hcy水平比較 TT基因型患者血清中Hcy水平最高，平均(20.17±8.87)μmol/L，而CC基因型患者血清中Hcy水平最低，平均(12.74±6.68)μmol/L，TC基因型患者血清中Hcy水平平均(14.62±9.55)μmol/L，對3種基因型患者血清中Hcy水平進行單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；進一步采用LSD-t對兩組間差異進行分析發(fā)現(xiàn)，CC型、TC型患者血清Hcy平均水平均顯著低于TT型患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 冠狀動脈狹窄程度與血清Hcy的關(guān)系 冠狀動脈狹窄程度C級患者血清Hcy水平最高，平均(19.84±7.97) μmol/L，而冠狀動脈狹窄程度A級患者血清Hcy水平最低，平均(13.48±7.69)μmol/L，冠狀動脈狹窄程度B級患者血清Hcy平均(16.79±8.06)μmol/L，采用單因素方差分析比較3組患者血清Hcy水平差異發(fā)現(xiàn)，3級患者血清Hcy水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；進一步對3組進行LSD-t檢驗發(fā)現(xiàn)，A、B級患者血清Hcy水平均顯著低于C級患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。將因變量定為是否冠心病，納入患者糖尿病、性別、高血壓、年齡吸煙史及Hcy水平為自變量，進行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示血清Hcy水平與冠心病的發(fā)生相關(guān)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(OR=1.079，P<0.05)。見表4。

表4 冠心病發(fā)生的危險因素分析

2.5 MTHFR(C677T)基因多態(tài)性與冠狀動脈狹窄程度的關(guān)系 通過秩和檢驗對患者MTHFR(C677T)基因多態(tài)性與冠狀動脈狹窄程度進行分析發(fā)現(xiàn)，不同基因型患者其冠狀動脈狹窄程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=183.800，P<0.05)；TT型患者冠狀動脈狹窄程度相比于TC、CC型更嚴重，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=9.951、12.930，P<0.05)；TC型患者冠狀動脈狹窄程度相比于CC型更嚴重，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=4.766，P<0.05)。見表5。以是否冠心病為因變量，納入患者糖尿病、性別、高血壓、年齡吸煙史及MTHFR(C677T)基因多態(tài)性為自變量，進行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示MTHFR(C677T)基因TT型和TC型與冠心病發(fā)生相關(guān)，但并不顯著(OR=1.240，P>0.05；OR=1.022，P>0.05)。見表6。

表6 是否患有冠心病

*：與CC基因型比較

3 討 論

Hcy屬于人體內(nèi)一類含硫氨基酸，其本身不參與蛋白的生物合成，而是代謝過程中的產(chǎn)物[7]。Hcy代謝的異常會促使動脈血管平滑肌細胞增生，提高血小板黏附能力，同時激活凝血因子，導(dǎo)致各種心血管疾病的發(fā)生；同時還會致使機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，抑制一氧化氮的合成，造成血管內(nèi)皮細胞損傷[8]。有研究證實，心肌梗死與高Hcy血癥發(fā)生關(guān)系十分密切，冠狀動脈血管病變與血清中Hcy水平呈正相關(guān)[9]；MAHALLE等[10]通過對300例患有冠心病的印度人群進行研究發(fā)現(xiàn)，在患有糖尿病及高血壓的冠心病患者中Hcy水平顯著增高，并且證實高Hcy是心血管疾病的危險因素。0一些對中國南方冠心病患者的研究得出了與其一致的結(jié)論[11]。本研究結(jié)果顯示，對照組血清Hcy水平顯著低于冠心病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；根據(jù)冠狀動脈狹窄程度的高低，將患者分為A級、B級和C級，隨著冠狀動脈狹窄程度的加深，血清Hcy水平逐漸升高，3組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；進一步分析冠心病發(fā)生的危險因素發(fā)現(xiàn)，除性別、年齡、高血壓、糖尿病、高脂血癥及吸煙史外，Hcy也是冠心病發(fā)生的獨立危險因素(OR=1.079，P>0.05)。

MTHFR維持機體蛋氨酸和葉酸正常的代謝過程，從而保證機體Hcy的正常水平[12]。MTHFR(C677T)基因突變會導(dǎo)致原編碼的丙氨酸被纈氨酸取代，同時在基因組上產(chǎn)生HinfⅠ限制酶識別位點，致使MTHFR催化活性降低，從而提高血清Hcy水平，引發(fā)高半胱氨酸血癥等其他代謝類疾病。RAJNEESH等[13]對北印度地區(qū)660例人群(其中331例正常對照與329例冠心病患者)進行研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR(C677T)位點處T等位基因頻率在冠心病患者中明顯高于健康對照組，他們認為MTHFR(C677T)等位基因變異提高了冠心病發(fā)生風(fēng)險。本研究發(fā)現(xiàn)，TT基因型患者血清中Hcy水平最高，CC基因型患者血清中Hcy水平最低，這與文獻[14-15]研究結(jié)果一致；MTHFR(C677T)基因多態(tài)性與冠狀動脈狹窄程度及冠心病的發(fā)生十分相關(guān)，在TT型中，冠狀動脈狹窄程度A級21例，B級49例，C級154例；在TC型中，冠狀動脈狹窄程度A級97例，B級151例，C級65例；而在CC型中，冠狀動脈狹窄程度A級98例，B級45例，C級20例；不同基因型患者，其冠狀動脈狹窄程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中TT型患者冠狀動脈狹窄程度最嚴重；以是否患有冠心病為因變量進行回歸分析發(fā)現(xiàn)，相比于CC基因型，TT及TC基因型均是冠心病發(fā)生的危險因素(OR=1.240，P>0.05；OR=1.022，P>0.05)。

本研究局限性在于回歸分析結(jié)果OR值風(fēng)險比值較低，比較并不顯著，而P值部分具有顯著性差異，其原因一方面與總體樣本量過少，使估計結(jié)果不穩(wěn)定，產(chǎn)生大的標準誤，使本來可能有意義的變量變得無統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)文獻[16]報道，如果樣本小于100，Logistic回歸分析的最大似然估計就有風(fēng)險，樣本含量還依賴于變量個數(shù)和數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)等條件，另一方面則與變量類別如吸煙、高血壓和高血脂等例數(shù)較少所致。綜上所述，在湖州市漢族人群中，血清Hcy水平及MTHFR(C677T)基因變異與冠狀動脈狹窄程度相關(guān)，其中高水平Hcy及MTHFR(C677T)TT與TC基因型均可能是冠心病發(fā)生的危險因素。