胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)改善糖尿病大鼠胰島素抵抗和增加外周脂肪和肌肉組織中GLUT-4基因表達*

左 瑩，劉菊華,2，嚴宗遜，雷 震△

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)科，四川南充 637000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610000)

糖尿病是一個全球性健康問題，至少1.5億人口深受其困擾，預(yù)計2025年這一數(shù)目將增長兩倍，而其中2型糖尿病(T2DM)患者占86%[1]。胰島素抵抗是T2DM葡萄糖利用障礙的主要原因，表現(xiàn)為外周組織對胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取功能障礙，胰島素介導(dǎo)葡萄糖進入外周組織最重要的載體是胰島素依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT-4)，增加外周脂肪胡肌肉細胞中GLUT-4基因的表達或轉(zhuǎn)運成為治療糖尿病改善糖代謝障礙的靶位點[2-4]。

目前對T2DM的治療主要包括藥物改善胰島素抵抗，增加胰島素分泌及胰島素替代治療，但是傳統(tǒng)的治療方案并不能顯著改善糖尿病患者的預(yù)后同時需要終身用藥。近年研究發(fā)現(xiàn)胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)可以改善肥胖型T2DM患者的胰島素抵抗，降低患者血糖，80%以上的患者術(shù)后降糖藥物的用量明顯減少，約半數(shù)以上的患者術(shù)后甚至不用藥物也可控制血糖[5]。2018年美國糖尿病協(xié)會(ADA)糖尿病診療指南指出對于體質(zhì)量指數(shù)大于30 kg/m2的肥胖性T2DM患者可采用胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)改善患者糖代謝紊亂[6]。目前胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)改善胰島素抵抗，降低血糖的具體機制尚不明確,本實驗擬通過對T2DM大鼠行胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)，觀察術(shù)后血糖及胰島素抵抗指數(shù)的變化，分析其與術(shù)后外周脂肪及肌肉組織中GLUT-4基因表達的相關(guān)性，探討胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)改善胰島素抵抗降低血糖的機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立及分組 正常健康6周齡雄性SD大鼠60只，購自川北醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號[scxk(川)2008-18]。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠分為T2DM組(n=40)及SD大鼠組(n=20)，SD大鼠組繼續(xù)喂養(yǎng)普通飲食，T2DM組參考VATANDOUST等[7]實驗方法采用高脂飲食聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素制備T2DM大鼠模型，空腹血糖(FBG)測量時間為大鼠禁食但不禁飲12 h后測量。T2DM大鼠成模標準：高脂喂養(yǎng)加注射鏈脲佐菌素后隔日1次采用One Touch Ultra血糖試紙(美國強生)監(jiān)測血糖，持續(xù)1周FBG穩(wěn)定且大于或等于7.0 mmol/L，最終成模T2DM大鼠35只。

將SD大鼠分為SD大鼠真手術(shù)組(NRO，n=10),SD大鼠假手術(shù)組(NSO,n=10),T2DM大鼠分為T2DM真手術(shù)組(DRO,n=20)及T2DM假手術(shù)組(DSO,n=15)。均以2.5%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠，真手術(shù)組參考RUBINO等[8]報道的手術(shù)方式行胃空腸轉(zhuǎn)流術(shù)，假手術(shù)組于真手術(shù)組相應(yīng)胃腸段行原位離斷后再行原位吻合術(shù)。手術(shù)完成后繼續(xù)喂養(yǎng)8周，處死大鼠，分離右后肢股四頭肌及附睪旁脂肪組織-90 ℃冰箱待用。

1.2 檢測項目 分別檢測手術(shù)前、術(shù)后4周及術(shù)后8周各組大鼠的FBG、空腹血漿胰島素(Fins)。以穩(wěn)態(tài)模型評估法(HOMA)計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR),公式HOMA-IR=(Fins×FBG)/22.5,HOMA-IR>6.0則存在胰島素抵抗。

1.3 GLUT-4基因表達的檢測 脂肪及肌肉組織中GLUT-4基因表達采用RT-PCR試劑盒測定，購自成都博瑞克生物技術(shù)有限公司(中國)。應(yīng)用HP1AS 2000型圖像分析系統(tǒng)測定吸光度。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠術(shù)前、術(shù)后FBG水平比較 至實驗結(jié)束，NRO組存活大鼠7只，NSO組9只，DRO組9只，DSO組8只。 術(shù)前SD大鼠FBG(5.86±1.13)mmol/L，T2DM組大鼠FBG(21.21±5.39)mmol/L，兩組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 術(shù)后4周,DRO組FBG較術(shù)前下降約14%，但與術(shù)前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),術(shù)后8周，DRO組FBG較術(shù)前下降約58%，與術(shù)前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。術(shù)后8周，DRO組的FBG明顯低于相應(yīng)時間點DSO組 (P<0.01)，但仍高于同時間點NRO及NSO組(P<0.05)；DSO組、NRO組、NSO組術(shù)前與術(shù)后FBG變化均差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)。見表1。

2.2 4組大鼠術(shù)前、術(shù)后HOMA-IR比較 術(shù)前SD大鼠HOMA-IR 4.76±1.08，糖尿病組大鼠HOMA-IR 21.38±7.07，兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。術(shù)后4周DRO組HOMA-IR較術(shù)前下降約27%，但與術(shù)前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，至術(shù)后8周HOMI-IR較術(shù)前下降約68%，與術(shù)前比較差異統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。術(shù)后8周，DRO組HOMA-IR明顯低于相應(yīng)時間點DSO組 (P<0.01)，與同時間點NRO組及NSO組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；DSO組、NRO組、NSO組術(shù)前與術(shù)后HOMA-IR均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

*：P<0.05與本組術(shù)前比較；#：P<0.05，術(shù)后8周與DRO組比較

表2 4組大鼠術(shù)前、術(shù)后HOMA-IR水平變化

*：P<0.05與本組術(shù)前比較；#：P<0.05，術(shù)后8周與DRO組比較

2.3 4組大鼠術(shù)后8周脂肪組織GLUT-4基因表達及其與FBG及HOMA-IR的相關(guān)性分析 術(shù)后8周，DRO組脂肪組織GLUT-4基因表達(0.88±0.17)較DSO組(0.58±0.09)增加(P<0.01),與NRO組(0.98±0.16)及NSO組(0.99±0.12)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖1。相關(guān)性分析顯示術(shù)后8周，脂肪組織中GLUT-4基因表達與FBG呈負相關(guān)(r=-0.89，P<0.01)，與HOMA-IR呈負相關(guān)(r=-0.88,P<0.01)。

圖1 各組大鼠脂肪組織組織中GLUT-4基因表達

2.4 4組大鼠術(shù)后8周肌肉組織GLUT-4基因表達及其與FBG及HOMA-IR的相關(guān)性分析 術(shù)后8周，DRO組肌肉組織GLUT-4基因表達(2.49±0.21)較DSO組(1.41±0.42)增加(P<0.01)，與NRO組(2.59±0.18)及NSO組(2.60±0.19)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。相關(guān)性分析顯示術(shù)后8周,大鼠肌肉組織中GLUT-4基因表達與FGB呈負相關(guān)(r=-0.95，P<0.01),與HOMA-IR呈負相關(guān)(r=-0.98，P<0.01)。

圖2 各組大鼠肌肉組織組織中GLUT-4基因表達

3 討 論

本實驗證實胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)后8周，T2DM大鼠FBG下降，胰島素敏感性增加，甚至可以恢復(fù)到正常大鼠水平，外周肌肉和脂肪組織中GLUT-4基因表達增加，且與FBG及胰島素抵抗指數(shù)呈負相關(guān)，因此胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)改善T2DM大鼠糖代謝的機制可能與術(shù)后脂肪組織和肌肉組織中GLUT-4基因表達增高相關(guān)。

GLUT-4屬于葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白超家族中的一員，在胰島素的刺激下，GLUT-4從細胞內(nèi)的存儲囊泡轉(zhuǎn)移到細胞膜表面，促進組織對葡萄糖的攝取，同時這也是外周脂肪及肌肉組織攝取葡萄糖的限速步驟，其表達或者轉(zhuǎn)位異常均可以引起胰島素抵抗[9]。在糖尿病患者的皮下脂肪中，GLUT-4基因表達較健康者明顯下降，并且與患者的胰島素抵抗指數(shù)呈負相關(guān)[10]。改善外周組織中GLUT-4的表達或者活性可以提高組織對葡萄糖的攝取能力，降低胰島素抵抗，達到治療糖尿病的目的。在傳統(tǒng)治療糖尿病的藥物中，PPARγ受體激動劑可通過PPARγ信號通路上調(diào)組織中GLUT-4的基因及蛋白表達，改善機體胰島素抵抗發(fā)揮降糖作用[11]。二甲雙胍作用于離體培養(yǎng)的3T3-L1脂肪細胞24 h，GLUT-4基因增加4.2倍，蛋白表達增加2.6倍，同時細胞對葡萄糖的攝取率增加2倍[12]；在離體培養(yǎng)糖尿病患者外周淋巴細胞的培養(yǎng)液中加入磺脲類藥物，12周后細胞對葡萄糖的攝取能力增加近6倍，表達GLUT-4的淋巴細胞從2.7%增加到15.5%[2]。有研究證實，胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)后28 d，大鼠肌肉組織中GLUT4的總蛋白含量及細胞膜表面的蛋白含量均顯著增加，而脂肪組織中GLUT4的總蛋白含量雖然沒有明顯改變，但細胞膜表面的GLUT4蛋白含量卻顯著增加[13]。本實驗進一步證實胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)后8周T2DM大鼠外周脂肪和肌肉組織中GLUT-4基因表達增加，外周脂肪及肌肉組織中GLUT-4基因表達與FBG及HOMA-IR呈負相關(guān)，因此胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)改善糖代謝的具體機制與術(shù)后外周脂肪及肌肉組織中GLUT-4基因的表達改變相關(guān)。

胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)增加GLUT-4基因表達的具體機制可能與術(shù)后胃腸激素及脂肪因子的含量改變相關(guān)。目前普遍接受的觀點是胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)后初期，糖代謝障礙改善的主要原因是腸-胰島素軸的變化，其中最主要的是GLP-1分泌增加[14-15]。采用GLP-1治療伴有胰島素抵抗的T2DM大鼠，大鼠脂肪組織中GLUT-4蛋白及基因表達均顯著增加，同時伴有血糖和HOMA-IR下降[16-17]。而腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可通過影響GLUT-4表達的轉(zhuǎn)錄因子活性降低GLUT-4基因表達[18]，胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)后TNF-α基因表達可顯著下降[19]。此外有研究證實，胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)增加GLUT-4基因的表達可能與術(shù)后PPARγ蛋白表達增加，胰島素信號通路中PI3K的活性增強相關(guān)[19]。

綜上所述，胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)可降低T2DM大鼠胰島素抵抗，改善糖代謝障礙，其機制可能與術(shù)后脂肪及肌肉組織中GLUT-4基因表達增加相關(guān)，而具體的信號通路有待于進一步研究證實。