蛋白激酶D2在血管緊張素Ⅱ誘導的病理性心肌肥大中的作用*

魏 薇，劉秋子，李琛琛，應開承，李 靜，李長林△

(1.濟寧醫學院公共衛生學院，山東濟寧 272067；2.濟寧醫學院精準醫學研究院，山東濟寧 272067；3.南開大學醫學院藥理學系，天津 300071)

病理性心肌肥大(PCH)心肌應對某些刺激時所表現出的一種適應性反應，主要表現為細胞增大。病理性心肌肥大是許多心血管疾病如高血壓、冠心病發展過程中的重要病理改變，其最終往往會導致心力衰竭、心律不齊，甚至猝死[1-2]。

病理性心肌肥大的發生是一個復雜的病變過程，目前關于其機制仍不是很清楚。以往研究表明，多種蛋白激酶在PCH的形成過程中扮演重要角色。目前已經發現多種蛋白激酶參與PCH形成過程。研究較為廣泛的有蛋白激酶C(PKC)[3]、蛋白酶激D(PKD)[4-5]、鈣調蛋白激酶Ⅱ(CAMKⅡ)[6]、絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)[7]。

PKD是一個色氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，有3個成員，即PKD1、PKD2和PKD3[8]。以往研究表明PKD1和PKD3在PCH的形成中發揮重要作用[4-5]。雖然關于PKD1和PKD3在參與病理性心肌肥大形成的研究比較多，但是關于PKD2是否參與心肌肥大調控缺少研究。本實驗旨在探討PKD2與PCH發生之間的關系，揭示PKD2在PCH形成中的作用，為干預和逆轉心肌肥大，預防和治療相關的心血管疾病提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、Trizol、α-actin和β-actin抗體購自美國Sigma公司。Anti-PKD2抗體購于美國Bioworld公司。LipofectamineTM2000購于美國Invitrogene公司。HRP-標記的山羊抗小鼠IgG 和山羊抗兔IgG購于武漢三鷹公司。Trizol、AlexaFluor-488(激發波長488 nm，最大發射波長519 nm，綠色)和碘化丙啶(PI，激發波長488 nm，最大發射波長630 nm，紅色)購于英國Abcam公司。SD成年大鼠和新生大鼠(乳鼠)，購自軍事醫學科學院動物實驗中心。

1.2 方法

1.2.1 心肌細胞分離 新生大鼠和成年大鼠心肌細胞分離參照本實驗室建立的分離方法[5]。

1.2.2 Real-time PCR分析 用Trizol裂解心肌細胞提取RNA，使用反轉錄酶反轉形成cDNA進行RT-PCR和Real-time PCR分析。RT-PCR引物為：PKD2：正向5′-ATC ACC GCC AAT GT CAC CTA CT-3′，反向5′-GTT TCT CCA TCA CCA CGA ATA CC-3′；18S rRNA：正向5′-ACC GCA GCT AGG AAT AAT GGA-3′，反向5′-GCC TCA GTT CCG AAA ACC A-3′；18s rRNA作為內參基因。Real-time引物為心房利尿因子(ANF)：正向5′-GGG GGT AGG ATT GAC AGG AT-3′，反向5′-CTC CAG GAG GGT ATT CAC CA-3′；β-肌凝蛋白重鏈(β-MHC),正向5′-CCT CGC AAT ATC AAG GGA AA-3′，反向5′-TAC AGG TGC ATC AGC TCC AG-3′[9]。

1.2.3 siRNA 干擾 針對PKD2基因設計兩個siRNA干擾位點，將兩個位點的siRNA序列混合后用LipofectamineTM2000轉染新生大鼠細胞。siRNA PKD2的兩個位點序列為：5′-CCU UCC UUA UAC AUA GCU ATT-3′，5′-CGG GCU GAA UUA CCA CAA ATT -3′；對照siRNA (NC siRNA) 序列:5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′。

1.2.4 Western blot分析 細胞蛋白用RIPA裂解液裂解，取等量的蛋白進行SDS-PAGE電泳。轉膜后與一抗4 ℃孵育過夜。應用過氧化物酶(HRP)標記的二抗顯色。

1.2.5 免疫熒光 細胞用4%的多聚甲醛固定5 min，0.5% triton×100穿透后血清封閉30 min，一抗孵育2 h，綠色熒光標記的二抗孵育1 h，進行共聚焦熒光顯微鏡分析(德國Leica公司)。應用LSM 800 Zeiss共聚焦熒光顯微鏡照相。

2 結 果

2.1 AngⅡ促進心肌細胞PKD2基因和蛋白表達 Western blot結果表明，AngⅡ(100 nmol/L)處理新生大鼠心肌細胞48 h顯著增加PKD2表達。與之相似，AngⅡ(100 nmol/L)處理成年大鼠心肌細胞24 h顯著上調PKD2蛋白表達。Real-time PCR顯示，PKD2的mRNA水平在AngⅡ誘導的PCH中也顯著上調。共聚焦熒光顯微鏡分析與Western blot和Real-time PCR結果一致，AngⅡ處理顯著增加PKD2蛋白在新生和成年大鼠心肌細胞中表達。見圖1。

A：Western blot分析；B：Real-time PCR分析；C：免疫熒光分析

圖1 PKD2在AngⅡ誘導的PCH中表達上調

A：降低PKD2抑制AngⅡ誘導ANF表達上調；B：降低PKD2抑制AngⅡ誘導β-MHC表達上調；C：PKD2的干擾效率

圖2降低PKD2抑制AngⅡ誘導的心肌肥大基因表達上調

A：α-actin熒光染色(×20)；B：細胞表面積分析；C:PKD2基因表達

圖3心肌細胞表面積分析

2.2 沉默PKD2可以抑制AngⅡ誘導的心肌肥大基因上調 經AngⅡ處理ANF基因表達顯著上調[(4.21±0.87)倍]。通過siRNA降低PKD2表達顯著抑制了AngⅡ誘導的ANF表達上調。與之相似，AngⅡ處理顯著上調β-MHC表達[(2.23±0.20)倍]，降低PKD2表達顯著抑制了AngⅡ誘導的β-MHC表達上調。見圖2。

2.3 降低PKD2表達阻斷AngⅡ誘導的心肌細胞表面積增大 AngⅡ處理顯著增大心肌細胞細胞面積，通過siRNA降低PKD2表達顯著抑制AngⅡ誘導心肌細胞增大。Real-time PCR結果顯示siRNA顯著降低PKD2表達。見圖3。

3 討 論

PCH發生機制非常復雜，目前普遍認為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)過度激活在PCH發生過程中起關鍵調控作用[10-13]。RAAS是一類由多種肽類激素和相應酶組成的體液調節因子的總稱。當受到病理刺激時，在腎素、血管緊張素轉化酶(ACE)、氨基肽酶A(APA)和氨基肽酶N(APN)等多個酶共同作用下，血管緊張素源轉變為AngⅠ、AngⅡ、AngⅢ和AngⅣ[14]。其中AngⅡ是介導RAAS參與PCH發生的重要效應因子。AngⅡ可以與細胞表面受體相結合，活化細胞內PCH相關的基因表達，最終導致PCH[12]。因此研究參與AngⅡ誘發PCH過程的關鍵基因，是發掘治療PCH新靶點的重要途徑。本研究發現，在PKD2在AngⅡ誘導的PCH中表達顯著上調，降低PKD2 表達可以有效抑制AngⅡ誘導的PCH標志基因ANF和β-MHC表達上調和心肌細胞表面增大。這表明，PKD2 在AngⅡ誘導的PCH過程中發揮重要作用，抑制其表達可以降低AngⅡ誘導的PCH。通過小分子抑制劑或基因干預方法抑制PKD2活性有可能會成為一種治療PCH的潛在新策略。

PKD廣泛參與細胞增殖、分化等多個生物學過程。PKD 有3個亞型：PKD1、PKD2和PKD3[8]。PKD1和PKD3參與PCH的發生。BOSSUYT等[15]研究發現，過表達PKD1可以使HDAC5超磷酸化，促使后者遷出細胞核進入細胞質，從而促進心肌肥大病程相關蛋白表達，導致PCH。TAN等[16]報道AngⅡ可以促進PKD1表達，介導PCH發生。以往研究表明，PKD3通過激活鈣調神經磷酶(CaN)，CaN促進活化T細胞核因子(NFAT4)去磷酸化，去磷酸化NFAT4進入細胞核增強PCH相關基因的表達，最終誘導PCH[5]。本研究發現，PKD2參與調控AngⅡ誘導的PCH發生。這表明PKD基因3個亞型PKD1、PKD2和PKD3均在PCD的發生過程起重要調控作用。MEREDITH等[17]研究發現PKD1選擇性抑制劑對防止實驗動物PCH的發生效果不理想。出現這一結果的原因可能會很多，但最可能的一個原因就是單一抑制PKD1亞型時，其他兩個亞型PKD2或PKD3仍然在PCD形成過程中發揮作用，誘導PCD發生。因此，探索能夠同時抑制PKD1、PKD2和PKD3的小分子化合物或基因干預方式可能是基于PKD靶點治療PCH的新思路。

綜上所述，PKD2在AngⅡ誘導的PCH中發揮重要作用，抑制PKD2表達能顯著降低AngⅡ誘導的PCH。