心脈隆注射液對(duì)ADP和花生四烯酸誘導(dǎo)血小板聚集的影響

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1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000;2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000

異常血栓形成是很多心腦血管疾病的起因，如腦中風(fēng)、心肌缺血和動(dòng)脈粥樣硬化[1]。在血栓形成的過程中，血管受損會(huì)激活血小板、引起其粘附和聚集并與纖維蛋白相互作用[2]。因此，血小板聚集是血栓形成的重要事件，其功能失調(diào)會(huì)促進(jìn)血栓性疾病的發(fā)展，而抗血小板聚集的藥物是治療心腦血管疾病的重要手段。

心脈隆注射液(Xinmailong injection，XML)是用美洲大蠊提取的生物活性物質(zhì)制成，主要活性成分是一些小分子肽和氨基酸，為國家二類新藥，用于治療慢性心力衰竭，適應(yīng)癥為心功能的C期、D期，臨床上無明顯不良反應(yīng)，可安全使用[3]。近年來發(fā)現(xiàn)XML在心腦血管疾病中有廣泛的藥理活性，如對(duì)缺血性腦中風(fēng)急性期有一定的治療作用，減少腦梗死面積[4]；對(duì)急性腦梗死合并慢性心力衰竭有輔助作用[5]；減輕氧化應(yīng)激損傷血管平滑肌[6]；抑制缺血缺氧后心肌細(xì)胞的凋亡[7]；對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化，降低血清膽固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白[8]，還能保護(hù)受到動(dòng)脈粥樣硬化損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞[9]。在這些疾病中均有血小板聚集的異常，而目前未見XML對(duì)血小板聚集作用的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用體外實(shí)驗(yàn)考察XML對(duì)二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate，ADP)和花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)誘導(dǎo)血小板聚集的作用，并探討XML對(duì)正常血小板是否有影響，以此了解XML對(duì)心腦血管疾病的作用是否與血小板功能有關(guān)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量280～320 g，許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002。

1.2 藥物與試劑 心脈隆注射液(批號(hào)：1703124，云南騰藥制藥股份有限公司)；一次性采血管(含129 mmol·L-1枸櫞酸鈉，批號(hào)：180906，瀏陽市三力醫(yī)用科技發(fā)展有限公司)；二磷酸腺苷(ADP，批號(hào)：716E022)和花生四烯酸(AA，批號(hào)：513B023)均購自北京索萊寶科技有限公司；替卡格雷(批號(hào)：C10061222，上海麥克林生物技術(shù)公司)；阿司匹林(批號(hào)：H172201，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.3 儀器 Agg RAMTM型血小板聚集儀(美國Helena公司)

2 方法

2.1 XML對(duì)ADP誘導(dǎo)血小板聚集的作用 取SD大鼠，10%水合氯醛(3mL/kg)麻醉后，分離腹主動(dòng)脈用含129 mmol/L枸櫞酸鈉的采血管取血，800 rpm，離心10 min后吸取上層的富含血小板血漿(PRP)，下層血漿再經(jīng)3500 rpm，離心10 min后吸取上層的貧含血小板血漿(PPP)。用PPP調(diào)整PRP至血小板數(shù)目為200×109個(gè)/L。將PRP隨機(jī)分為4組：溶劑對(duì)照(生理鹽水)組，陽性藥替卡格雷(0.05 g/L)組，XML 1、0.5 g/L組。將各組藥物加入PRP中(37 ℃)混勻孵育5 min，再加入ADP(10 μmoL/L)誘導(dǎo)血小板聚集，于血小板聚集儀中記錄血小板聚集曲線及血小板的最大聚集率，計(jì)算藥物對(duì)血小板聚集的抑制率 = (溶劑對(duì)照組血小板最大聚集率-藥物組最大血小板聚集率)/溶劑對(duì)照組血小板最大聚集率×100%。

2.2 XML對(duì)AA誘導(dǎo)血小板聚集的作用 同上制備PRP和PPP，調(diào)整PRP至血小板數(shù)目為500×109個(gè)/L，同上對(duì)PRP分組，陽性藥為0.1 g/L的阿司匹林，誘導(dǎo)劑為AA(0.5 mmoL/L)。藥物孵育PRP后加入AA誘導(dǎo)血小板聚集，記錄血小板的最大聚集率，計(jì)算藥物對(duì)血小板聚集的抑制率。

2.3 XML對(duì)正常血小板的作用 制備PRP和PPP，調(diào)整PRP至血小板數(shù)目為200×109個(gè)/L，將PRP隨機(jī)分為4組：溶劑對(duì)照(生理鹽水)組，XML高、中、低濃度組(1、0.5、0.25 g/L)組。用藥物孵育PRP后，直接記錄血小板聚集曲線和血小板最大聚集率，觀察XML對(duì)正常血小板的作用。

3 結(jié)果

3.1 XML抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集 與溶劑對(duì)照組相比，1 g/L的XML能顯著性抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，抑制率為7.8%；而0.5g/L的XML作用不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。陽性藥替卡格雷抑制ADP致血小板聚集作用非常明顯(P<0.01)，抑制率高達(dá)77.4%。結(jié)果見圖1和表1。

圖1 XML對(duì)ADP誘導(dǎo)血小板聚集的作用

組別濃度/g·L-1血小板最大聚集率/%抑制率/%溶劑對(duì)照71.5 ± 2.0替卡格雷0.05 16.1 ± 3.8??77.4 ± 5.0 XML1 65.3 ± 1.4??7.8 ± 1.60.569.9 ± 2.62.6 ± 3.0

注：與溶劑對(duì)照組比較，**P< 0.01。

3.2 XML抑制AA誘導(dǎo)的血小板聚集 XML抑制AA誘導(dǎo)血小板聚集的作用要優(yōu)于抑制ADP對(duì)血小板聚集的誘導(dǎo)作用。與溶劑對(duì)照組相比，1 g/L和0.5 g/L的XML均能顯著性抑制AA誘導(dǎo)的血小板聚集，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.01)，抑制率分別達(dá)到為57.7%和20.5%。與1 g/L的XML相比，陽性藥阿司匹林也能明顯抑制AA誘導(dǎo)的血小板聚集(P<0.01)，抑制率為57.4%。結(jié)果見圖2和表2。

圖2 XML對(duì)AA誘導(dǎo)血小板聚集的作用

組別濃度/g·L-1血小板最大聚集率/%抑制率/%溶劑對(duì)照42.3±2.3阿司匹林0.117.7±2.7??57.4±5.7XML1 17.4±5.6??57.7±14.40.532.8±6.3??20.5±17.6

注：與溶劑對(duì)照組比較，**P<0.01。

圖3 XML對(duì)正常血小板的作用

3.3 XML誘導(dǎo)血小板聚集 由圖3、表3可知，直接加入XML不能誘導(dǎo)血小板聚集。與溶劑對(duì)照組相比，加入1 g/L、0.5 g/L和0.25 g/L的XML后，血小板的最大聚集率均無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

組別濃度/g/L血小板最大聚集率/%溶劑對(duì)照8.1±4.1XML306.8±3.5157.6±2.67.57.2±5.4

4 討論

血管損傷后，很多活性物質(zhì)從內(nèi)皮細(xì)胞釋放，趨化血小板粘附于受損部位，并與相應(yīng)的表面受體結(jié)合活化血小板?；罨难“遽尫艃?chǔ)存的物質(zhì)，如ADP、血清素、血小板活化因子、AA誘導(dǎo)的血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)等，啟動(dòng)并促進(jìn)血小板聚集。誘導(dǎo)血小板聚集的共同通路為引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加來激活血小板膜上的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa[10-13]。本實(shí)驗(yàn)中，心脈隆注射液(XML)對(duì)ADP和AA誘導(dǎo)的血小板聚集均有濃度依賴性的抑制作用，而對(duì)AA介導(dǎo)途徑的作用明顯強(qiáng)于ADP介導(dǎo)途徑，這可能與XML調(diào)節(jié)AA途徑中的幾個(gè)重要因子有關(guān)。有研究表明，XML能對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，升高動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的一氧化氮(Nitric oxide，NO)和前列環(huán)素(Prostaglandin I2，PGI2)水平，并降低內(nèi)皮素(Endothelin，ET)水平，能減少血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)水平但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[9]。由于NO和PGI2可抑制血小板聚集，而ET和TXA2(TXA2半衰期很短，其含量用下游產(chǎn)物TXB2表示)促進(jìn)血小板聚集，XML對(duì)這些因子的作用均有利于其抑制AA誘導(dǎo)的血小板聚集。另外，在ADP誘導(dǎo)血小板聚集途徑中，ADP激活血小板表面ADP受體后，使細(xì)胞內(nèi)cAMP降低并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，啟動(dòng)血小板聚集[10]。目前未見XML對(duì)ADP和cAMP作用的報(bào)道，而有研究表明XML能增加心衰心肌細(xì)胞的Ca2+內(nèi)流[14]。盡管XML對(duì)血小板的細(xì)胞內(nèi)Ca2+作用可能不同于對(duì)心肌細(xì)胞的作用，這種XML對(duì)Ca2+作用也可能與XML對(duì)ADP誘導(dǎo)血小板聚集作用較弱有關(guān)。實(shí)驗(yàn)也考察了XML對(duì)正常血小板的作用，發(fā)現(xiàn)所有濃度的XML均不會(huì)誘導(dǎo)血小板聚集。

目前，XML在臨床的主要適應(yīng)癥為心功能C期與D期、紐約心臟病分級(jí)Ⅱ-Ⅳ級(jí)的心衰患者，可單獨(dú)使用，也可以合用洋地黃、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、利尿劑、β-受體阻滯劑等。另外，XML對(duì)心腦血管缺血性疾病顯示出一定的療效，如急性心肌梗死[15]和急性腦梗死合并心力衰竭[5]。對(duì)這些缺血性疾病的治療過程中，在使用常規(guī)的抗血小板藥、抗凝藥和調(diào)脂藥的基礎(chǔ)上使用XML后發(fā)現(xiàn)能縮小梗死范圍[15]，減輕神經(jīng)功能缺損[5]，除了XML具有對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化[9]、抑制過度自由基氧化[16]、抗心律失常[17]、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖[18]，并分化為神經(jīng)元的作用外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明XML對(duì)異?；罨难“骞δ芤灿凶饔茫浔旧砟苤苯右种蒲“寰奂?，改善血液流變學(xué)。實(shí)驗(yàn)提示在合用抗血小板藥物時(shí)，XML更適合合用抑制ADP途徑的藥物(如氯吡格雷)優(yōu)于合用抑制AA途徑的藥物(如阿司匹林)，這是因?yàn)樗幬锫?lián)合使用通?？紤]合用不同機(jī)制的藥物，而XML主要抑制AA誘導(dǎo)的血小板聚集，未見血栓傾向的心腦血管疾病使用XML也不會(huì)影響正常的血小板功能。綜上所述，實(shí)驗(yàn)為XML治療缺血性心腦血管疾病提供了可能的一種機(jī)制。