高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定牙膏中蒙花苷含量

王亞茹　熊小婷　夏澤敏　黃日林　譚焯針　佘文勛

【摘 要】建立了一種牙膏中蒙花苷的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）檢測方法。樣品經(jīng)純水充分分散后，經(jīng)乙腈超聲提取，采用HPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測模式定性定量分析。對液相色譜條件及質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，在優(yōu)化的條件下，蒙花苷在5.0～200.0μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9987;檢出限和定量限分別為0.015μg/g和0.05μg/g;選取低、中、高三個濃度5.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，平均回收率為91.4～95.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<3.70%。本方法簡單易行、靈敏可靠，可應(yīng)用于實際牙膏樣品中蒙花苷的測定。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜;蒙花苷;牙膏;檢測

中圖分類號： O657.63;TS264.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A文章編號： 2095-2457（2019）31-0187-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.31.090

野菊花為多年生草本植物野菊的頭狀花序，外形近似菊花，具有治療疔瘡癰腫、咽喉腫痛、風(fēng)火赤眼、頭暈?zāi)垦５劝Y狀，同時可以作為降血壓和血糖的輔助療法，在牙膏中添加野菊花提取物具有抑菌消炎、抗不良刺激的作用。蒙花苷是野菊花的主要藥效成分，也是我國2010和2015版藥典中明確規(guī)定的野菊花藥材的質(zhì)控指標(biāo)[1]。近年來，一些植物提取物被商家以功效成分添加到牙膏中，以此對外宣稱為功效型牙膏，野菊花提取物蒙花苷便是其中的典型代表。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 2966-2014《功效型牙膏》中規(guī)定，功效性牙膏中的功效成分應(yīng)進(jìn)行定性定量檢測[2]，然而，目前尚無針對功效型牙膏中蒙花苷含量檢測的方法標(biāo)準(zhǔn)。因此，開展對牙膏中功效成分蒙花苷的檢測研究，對于幫助生產(chǎn)企業(yè)實現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控、保護(hù)消費者權(quán)益具有重要意義。

目前蒙花苷的檢測研究報道多針對藥材及中藥制劑[3-7]，報道的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）和超高效液相色譜法（UPLC）。對于牙膏中蒙花苷的檢測研究，劉廣源等[8]曾報道了一種采用HPLC測定牙膏中蒙花苷含量的方法。然而，在實際檢測中發(fā)現(xiàn)，由于牙膏基質(zhì)成分復(fù)雜，采用HPLC分析時會存在雜質(zhì)干擾嚴(yán)重或容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果的情況。牙膏中蒙花苷添加含量一般為數(shù)μg/g，采用HPLC分析時需更大樣品量，同時雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，為解決HPLC的不足，本文采用HPLC-MS/MS法建立了牙膏中蒙花苷含量檢測方法。HPLC-MS/MS法集HPLC和MS/MS的優(yōu)點于一體，既能實現(xiàn)快速分析，又能準(zhǔn)確定性，同時具有更高的靈敏度。本文所建方法，樣品經(jīng)水和乙腈提取后，上機(jī)分析僅需8min，大大提高工作效率，且有著較高的靈敏度，目標(biāo)物在樣品中的檢出濃度可達(dá)0.015μg/g。

1 試驗

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器：Agilent 1290Ⅱ-6495B高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國安捷倫有限公司;色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.1×100mm，2.7μm），美國安捷倫有限公司;超聲波清洗儀，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司;高速離心機(jī)，曦瑪離心機(jī)（揚州）有限公司;萬分之一分析天平、十萬分之一分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司;純水儀，美國Merck millipore公司。

主要試劑：蒙花苷標(biāo)準(zhǔn)品，純度99.2%，上海安譜科學(xué)儀器有限公司;乙腈、甲醇，色譜純，美國默克公司;甲酸、乙酸銨，優(yōu)級純，上海安譜科學(xué)儀器有限公司;超純水，由純水儀制備。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制

精密稱取0.0100g的蒙花苷標(biāo)準(zhǔn)品于10mL棕色容量瓶中，用二甲基亞砜溶解并定容至刻度，配置成1000mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃避光保存。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

準(zhǔn)確移取適量體積的蒙花苷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1.2）于10mL棕色容量瓶中，用乙腈配制成濃度為10.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，臨用前用乙腈稀釋成濃度為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、150.0、200.0μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取牙膏樣品1.0g（精確至0.001g）于10mL具塞棕色比色管中，加入2mL超純水，渦旋30S，再加乙腈定容至刻度，渦旋30s，超聲20min，渦旋混勻，靜置10min，取上清液過0.22μm有機(jī)濾膜，待測。

1.5 儀器條件

色譜條件：色譜柱：Proshell 120 SB-C18（2.1*100mm，2.7μm）;流速：0.3mL/min;流動相：A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈;洗脫程序：梯度洗脫，0～2min，流動相A比例為90%，2～3min，流動相A由90%變?yōu)?0%，3～6min，流動相A 30%保持不變，6.1～8min，流動相A比例為90%;進(jìn)樣體積：3μL。

質(zhì)譜條件：離子源：ESI源;檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式;掃描模式：正離子模式;干燥氣溫度： 325℃，流速：6.0 L/min;鞘氣溫度：300℃，流速：11.0L/min，定量離子對：593.3→285.3，碰撞能量：29eV;定性離子對：593.3→447.4，碰撞能量：17 eV;碎裂電壓380 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

對濃度為500.0μg/L的蒙花苷標(biāo)準(zhǔn)溶液在電噴霧離子源下分別進(jìn)行正離子和負(fù)離子全掃描分析，結(jié)果顯示，正離子模式下獲得分子離子峰的響應(yīng)較佳，因此選擇正離子模式下進(jìn)行分析。采用子離子掃描方式進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的兩個特征碎片離子分別作為定量離子和定性離子。針對所選定量離子和定性離子對碰撞能量、干燥氣溫度和流速等條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，確定最終的質(zhì)譜分析條件。

2.2 流動相的選擇

牙膏樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，為了更好地降低基質(zhì)對分析結(jié)果的影響，色譜分離采用了梯度洗脫的方式進(jìn)行。對比考察了0.1%甲酸水溶液+甲醇、0.1%甲酸水溶液+乙腈、0.1%甲酸水溶液+0.1%甲酸乙腈溶液三組流動相的分析效果，結(jié)果顯示，三組流動相都能實現(xiàn)良好分離，但采用乙腈作為流動相時，蒙花苷的響應(yīng)較好。因此，最終選取0.1%甲酸水溶液+乙腈作為流動相。優(yōu)化后的的總離子流色譜圖和提取離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 蒙花苷總離子流色譜圖和提取離子流色譜圖

2.3 線性、檢出限和定量限

將系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（1.3）按照1.5的分析條件進(jìn)行測定，以定量離子對色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，待測組分蒙花苷的質(zhì)量濃度X（μg/L）為橫坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，蒙花苷在5.0～200.0μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性相關(guān)性，線性回歸方程為Y=500.66X+174.70，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9987。方法檢出限（S/N=3）為0.015μg/g，方法定量限（S/N=10）為0.05μg/g。

2.4 方法的回收率和精密度

選擇未檢出蒙花苷的牙膏樣品作為加標(biāo)基質(zhì)，分別加入一定體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到加標(biāo)濃度分別為5.0、50.0、100.0μg/L的低、中、高3個加標(biāo)濃度水平，每個濃度水平進(jìn)行6次平行測定，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，三個濃度水平的平均回收率在91.4～95.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于3.70%。結(jié)果說明本方法準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好，可以滿足日常牙膏中蒙花苷的測定要求。

表1 不同濃度蒙花苷在牙膏樣品中加標(biāo)回收率及RSD

2.5 實際樣品的檢測

從超市隨機(jī)購買5批外包裝標(biāo)識含有野菊花提取成分的牙膏樣品，采用本文所建方法進(jìn)行測定。結(jié)果顯示5批樣品均未檢出蒙花苷。

3 結(jié)論

本文建立了一種牙膏中野菊提取成分蒙花苷的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。方法簡單易行、靈敏可靠，可應(yīng)用于實際牙膏樣品中蒙花苷的測定。對5批標(biāo)識含有野菊花提取成分的牙膏樣品進(jìn)行測定，結(jié)果均未檢出蒙花苷。

【參考文獻(xiàn)】

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[8]劉廣源，張琥，費振玉.高效液相色譜法測定牙膏中蒙花苷的含量[C].中國口腔護(hù)理用品工業(yè)學(xué)術(shù)研討會，2014.