支氣管肺發育不良早產兒血中RELM-β、VEGF表達及意義

邵 婕 徐 艷 王 軍

支氣管肺發育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早產兒、尤其是小早產兒肺部常見疾病,近年來，伴隨醫療水平的改善，小早產兒成活率大大提高，隨之帶來BPD患兒人數增多；BPD病死率較高，存活者在早期離氧難、喂養難，嬰兒期肺功能較差，再入院率明顯高于正常嬰兒，給患兒家庭及社會帶來很大的精神、經濟壓力。目前尚無有效的治療BPD的辦法，因此早期識別及預防BPD顯得尤為重要。RELM-β是一種在肺組織、血液、胃腸等組織表達的蛋白，在哮喘、COPD等多種呼吸道疾病中起到參與血管重建、調節肺纖維化進程、發揮炎性效應等作用，而BPD恰恰是炎性反應修復的結果[1]；VEGF被認為是一種促進血管新生的重要因子，對肺上皮細胞的生長發育有重要作用。本研究通過監測早產兒生后血清RELM-β、VEGF水平變化，探討血清RELM-β、VEGF蛋白表達在早產兒BPD早期發病過程中的作用。

對象與方法

1.對象與分組：選取2017年1月～2018年7月在徐州醫科大學附屬醫院兒科醫院NICU住院早產兒52例。納入標準：胎齡在28～32周且出生體重<1500g，入院后即應用呼吸機支持且住院時間超過28天的早產兒。排除標準：先天發育畸形、嚴重先天性心臟病、先天性腫瘤、遺傳代謝性疾病。根據有無BPD分為BPD組(n=24)和非BPD組(n=28) 。BPD診斷標準參照美國國立兒童健康與人類發展研究院在BPD研討會中提出的標準：任何氧依賴(>21%)≥28d的新生兒即可診斷為BPD。本研究已通過徐州醫科大學附屬醫院倫理學委員會批準，征得患兒家長同意，并簽署知情同意書。

2.實驗方法

(1)標本收集及主要實驗器材：收集患兒胎齡、出生體重、Apgar評分、性別、分娩方式等一般資料，于出生后3天內、7天、14天分別采集外周血1ml，肝素抗凝管保存，采集標本后 30min內離心 15min(4℃，2000r/min，離心半徑為10cm)，分離血清，分別于-80℃冰箱保存。電泳儀(DYCZ-40) 購自美國Bio-Rad公司,凝膠成像系統購自天津市漢中攝影材料廠。酶標儀(DENLEY DRAGON Wellscan MK 3)購自美國Thermo公司。抗人RELM-β、VEGF購自美國Bio-Rad公司。人RELM-β、VEGF ELISA 試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

(2)ELISA法檢測血清RELM-β、VEGF水平：從-80℃超低冰箱中取出保存的血漿，室溫解凍后離心(3000r/min，離心半徑10cm，離心15min)，待檢測。將各種試劑移至室溫(18～25℃)平衡30min，并配制試劑備用。取出酶標板，分別設標準品孔、待測樣品孔，每孔分別加標準品或待測樣品100μl，輕輕晃動混勻，貼上板貼，37℃溫育2h，棄去液體，甩干。每孔加生物素標記抗體工作液100μl，覆上新的板貼，37℃溫育1h，棄去孔內液體，甩干，洗板3次。每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液100μl，覆上新的板貼，37℃溫育1h，棄去孔內液體，甩干，洗板5次。依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色15～30min。依序每孔加終止溶液50μl，終止反應。在反應終止后5min內用酶標儀在450nm波長依序測量各孔吸光度(A值)，然后計算樣本濃度。

(3)Western blot法檢測血清RELM-β、VEGF水平：從-80℃超低溫冰箱中取出保存的上清液，采用 BCA 法測定蛋白濃度水平，等量等體積(20μl)蛋白樣本上樣。采用 80V/120V電壓電泳，使檢測蛋白到達最佳分辨區；轉膜將蛋白轉到 PVDF膜上，用 Western 封閉液封閉 2h，分別孵育 RELM-β一抗(1∶1000)、β-actin 一抗(1∶1000)，4℃過夜；之后將 PVDF 膜在二抗 (1∶50000)中搖床孵育 2h；ECL增強液顯色；用掃描儀獲取圖像，運用Image-J圖像分析軟件分析各目的條帶的灰度值。以RELM-β、β-actin 的灰度值比值確定RELM-β表達的相對水平。

結 果

1.一般資料分析:BPD組共24例，其中男性14例，女性10例，出生胎齡30.44±1.57周，出生體重1390±330g；非BPD組共28例，其中男性13例，女性15例，出生胎齡30.82±1.70周，出生體重1370±220g。兩組早產兒出生胎齡、體重、性別等，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 兩組早產兒臨床資料比較

2.ELISA法檢測兩組血清RELM-β、VEGF水平：兩組的血清RELM-β水平生后3天內較低，隨后逐漸上升，14天達到高峰，組內各時間點兩兩比較，差異有統計學意義；BPD組RELM-β水平在各個時間點之間都高于非BPD組，3天內兩組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，7天、14天兩兩比較，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表2。兩組的血清VEGF水平生后3天內最低，后逐漸上升，14天最高，組內不同時間點之間兩兩比較，差異有統計學意義(P<0.05)；各個時間點BPD組的VEGF水平均低于非BPD組，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表3。

表2 各組早產兒不同時間點血清RELM-β水平比較

3.Western blot法檢測兩組血清RELM-β水平：兩組的血清RELM-β水平生后3天內較低，隨后逐漸上升，14天達到高峰，組內各時間點兩兩比較，差異有統計學意義(P<0.05)；BPD組RELM-β水平在各個時間點之間都高于非BPD組，3天內兩組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，7天、14天兩組VEGF水平比較差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表4、圖1。兩組的血清VEGF水平生后3天內最低，后逐漸上升，14天最高，組內不同時間點之間兩兩比較，差異有統計學意義(P<0.05)。各個時間點BPD組的VEGF水平均低于非BPD組，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表5、圖2。

表3 各組早產兒不同時間點血清VEGF水平比較

表4 各組早產兒不同時間點血清RELM-β蛋白表達水平比較

表5 各組早產兒不同時間點血清VEGF蛋白表達水平比較

圖1 Western blot法檢測兩組血清RELM-β表達水平

圖2 Western blot法檢測兩組血清VEGF表達水平

討 論

支氣管肺發育不良發病原因多種，極低出生體重、機械通氣等為BPD的高危發病因素[2]。現多認為BPD的發病是以遺傳易感性為基礎，宮內、出生后多種不利因素的共同作用下引起肺損傷及損傷后異常修復， IL-8、TGF-β、MMP-9等多種細胞因子參與其中[3,4]。BPD尚無有效治療手段，且預后不佳。BPD患兒在新生兒期用氧時間長，易合并早產兒視網膜病變、呼吸機相關肺炎等疾病，嚴重可致死亡；在嬰兒期至青春期，合并哮喘等呼吸道疾病的概率較大，神經系統障礙發生率也顯著高于非BPD早產兒[5，6]。

抵抗素樣分子β(RELM-β)是抵抗素樣分子家族中的一員，目前被發現的家族成員還有RELM-α、resistin 、RELM-δ。RELM-β與RELM-α有密切同源性。在小鼠肺組織中，RELM-α通過ERK/MAPK-PI3K/Akt信號通路參與肺損傷后的肺血管重塑、肺動脈高壓等過程，也參與小鼠支氣管肺發育不良的發病[7，8]。RELM-β最早在結腸發現，后來被證實在肺、心臟等組織中也有表達，RELM-β可作為促有絲分裂因子，誘導小鼠的肺纖維化，刺激氣道上皮細胞增殖，促進黏蛋白、生長因子等多種轉化介質的產生，參與肺血管重塑[9]。有研究者在探究RELM-β在氣道重塑中作用的體外實驗中發現，當RELM-β的表達增多時， RELM-β可誘導氣道上皮細胞增殖，通過ERK/MAPK-PI3K/Akt信號通路，促進血管內皮生長因子(VEGF)分泌,這也說明RELM-β與RELM-α在不同物種內可能通過相似的通路發揮作用[10]。

VEGF在富血管組織中皆有分布，如腫瘤組織、肺組織等，在肺組織中，由Ⅱ型肺泡上皮細胞分泌，對肺血管的形成、修復起到舉足輕重的作用，可通過PLC-IP3-前列腺素通路改善血管通透性，經PI3K/Akt-NOS-NO通路刺激血管新生，通過PI3K-PIP3-Akt/PKB通路信號通路減輕肺泡損傷，在慢性阻塞性肺疾病、非小細胞肺癌中與疾病嚴重程度相關[11]。有研究表明BPD小鼠肺組織內呈低水平的VEGF分布,提示低VEGF與BPD發病相關，應用重組VEGF治療后的受損肺組織的肺泡數量及肺微血管密度得到一定程度的改善[12]。

綜上筆者推測，參與多種肺部、血管相關性疾病病理生理過程的RELM-β、VEGF在BPD發生過程中可能也發揮一定的作用。本研究中患兒胎齡、體重小，肺發育不成熟，絕大部分有氧氣應用史，而在臨床治療過程中，呼吸支持常伴隨著氧供給、機械通氣損傷、氧自由基生成，損傷肺組織；另外宮內、宮外感染等可引起炎性因子的大量釋放，造成氣道損傷，在各方面綜合因素影響下，導致了BPD的形成。本研究結果顯示，BPD組患兒各個時間點RELM-β表達均高于非BPD組，3天內兩組RELM-β水平比較差異無統計學意義，7天、14天兩組RELM-β水平比較差異有統計學意義(P<0.05)；兩組VEGF表達水平生后3天內最低，后逐漸上升，14天最高，各個時間點BPD組的VEGF水平均低于非BPD組，差異有統計學意義(P<0.05)。結果提示，BPD早產兒RELM-β表達水平較高，而BPD早產兒VEGF表達水平則低于非BPD早產兒。

有國外研究提示BPD早產兒出生后體內VEGF水平低于非BPD早產兒[13]。這與本研究結果相符合， VEGF水平表達減低和BPD的發病相關，聯合應用VEGF、Ang-Ⅱ等干預后的BPD小鼠肺組織呈現出新生血管網增多、肺部炎癥及水腫明顯減輕等現象，提示VEGF參與肺損傷后的修復，BPD患兒體內VEGF水平低恰恰可能導致肺損傷后修復不足[14]。前文提到RELM-β分泌增多后可刺激VEGF的正向生成，筆者推測，在BPD的病理生理改變開始后，機體可能通過代償性上調RELM-β的分泌，刺激 VEGF正向生成，從而促進微血管新生，調節毛細血管通透性，改善肺泡氧合，對高氧、機械通氣等造成的肺損傷進行修復，改善停滯的肺發育；當病情進展，肺損傷越來越重時，機體或選擇進一步增加RELM-β的分泌來代償加重的肺損傷。

綜上所述，筆者推測RELM-β、VEGF可能作為保護性細胞因子，參與BPD患兒早期發病后的組織損傷修復，這為預測、干預BPD早期發病與進展提供更多思路。但是本研究樣本量較小，追蹤時間較短，尚未監測到RELM-β水平的高峰時間點，在接下來的進一步研究中，需進一步擴大樣本量，延長監測時間，深入探究RELM-β在BPD發展過程中的意義。