Graves病患者外周血單個核細胞中microRNA-142-3p的表達水平及其意義

胡 婷 裴曉艷 于 磊 徐二琴 金國璽

Graves病是一種自身免疫性疾病，Graves病在女性中發(fā)生率約為3%，另有0.5%的男性在其一生中會有發(fā)展為Graves病的可能性[1]。微小RNA是一類廣泛存在于真核生物中的非編碼單鏈小RNA分子，通過降解靶基因mRNA 或抑制其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的生成參與調(diào)控人體一系列重要生理病理反應(yīng)，特別是與機體免疫功能關(guān)聯(lián)密切。近年來，越來越多的研究表明許多微小RNA在甲狀腺功能亢進中發(fā)揮重要作用[2]。有研究報道在甲狀腺組織以及Graves病患者中有miRNA異常調(diào)節(jié)的現(xiàn)象，有些與外周血單核細胞表達有關(guān)的特定miRNA可能成為治療Graves病的新靶點[3，4]。未成熟的miR-142產(chǎn)生兩種異構(gòu)形式，即引導(dǎo)鏈miR-142-3p和副鏈miR-142-5p，其中miR-142-3p主要分布于T細胞，起到CD4+T細胞負性調(diào)控因子的作用，能夠降低CD4+T細胞的生物活性。miR-142-3p表達失調(diào)與多種人類疾病有關(guān)，包括各種炎性疾病、癌癥、胚胎發(fā)育異常等，尤其是對免疫相關(guān)疾病有較大影響[5，6]。探索miR-142-3p在各種疾病中的作用逐漸成為研究熱點，但其在甲狀腺自身免疫性疾病中的國內(nèi)外研究極少，尤其是Graves病方面，國內(nèi)目前仍未見相關(guān)報道。本項實驗擬探究miR-142-3p在Graves病中的可能作用，并試討論其能否成為Graves病診治的新的生物學(xué)標志物與干預(yù)靶點。

對象與方法

1.研究對象：選擇2018年2月～2018年7月期間于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科門診確診為Graves病的患者37例，同期收集體檢中心的健康志愿者15例，分別作為GD組和正常對照組。兩組研究對象性別、年齡等一般情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本實驗已取得筆者醫(yī)院倫理學(xué)委員會審批，所有患者均知情同意，并簽署知情同意書。

2.GD組納入標準：①患者有多食善饑、體重降低、怕熱多汗、心率增快等高代謝癥狀和體征；②甲狀腺不同程度腫大；③外周血FT3、FT4增高，TSH減低，TRAb增高。排除標準：妊娠或哺乳期女性、合并感染者、合并其他內(nèi)分泌疾病、合并其他各系統(tǒng)器質(zhì)性疾病。

3.正常對照組(健康組)納入標準：①外周血 FT3、FT4、TSH 正常；②全身各系統(tǒng)體檢結(jié)果正常；③年齡、性別與GD組相匹配。妊娠、哺乳期女性除外。

4.PBMC與提取總RNA:兩組研究對象分別于清晨抽取外周靜脈血5ml，全血置于EDTA抗凝管中，加入淋巴細胞分離液5ml，以密度梯度離心法進行分離，取其外周血單個核細胞(PBMC)。用總RNA快速提取試劑盒(上海Sagon公司)按操作說明提取總RNA。

5.RT-qPCR檢測miR-142-3p表達水平：采用ABScriptⅡ cDNA First-Strand Synthesis Kit試劑盒(武漢ABclonal公司)進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；采用2X SYBR Green Fast qPCR Mix No Rox試劑盒(武漢ABclonal公司)進行qPCR。該實驗以U6為內(nèi)參，U6和miRNA引物由上海傲集生物科技有限公司合成。miR-142-3p反轉(zhuǎn)錄引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-TCCATA-3′； miR-142-3p上游引物序列：5′-CAGCTGGGTGTAGTGTTTCCTACTT-3′；MiR-142-3p下游引物序列：5′-ACGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；U6下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；RT反應(yīng)體系：2μg RNA溶液，Oligo(dT)18(1μl)，5×Reaction Buffer(4μl)，10mmol/L dNTP Mix(2μl)，RNAase抑制劑(20U/μl，1μl)和反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μl，1μl)。65℃預(yù)變性5min，42℃保溫60min，結(jié)束后70℃保溫5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。qPCR反應(yīng)體系：2×qPCR Mix(12.5μl)；7.5μmol/L基因引物(2.0μl)；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(2.5μl)；ddH2O(8.0μl)。反應(yīng)條件95℃預(yù)變性10min， 95℃15s，60℃60s，循環(huán)40次，反應(yīng)結(jié)束后60℃→95℃，每30s升溫1℃條件下進行熔解曲線分析。每個樣本均進行3次檢測，應(yīng)用2- △△ C t法計算miRNA-142-3p的相對表達水平。

6.ELISA法檢測相關(guān)指標：每例于清晨空腹抽取外周靜脈血2ml，室溫靜置1h后在4℃下以3000r/min離心10min，取上層血清進行檢測，采用化學(xué)發(fā)光法，測定血清TSH、TT3、TT4、FT3、FT4、TRAb等指標(美國Siemens Healthcare Diagnostics公司)。

7.統(tǒng)計學(xué)方法：本研究采用Graph Pad Prism 5.0做圖，采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差(x±s)表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布采用t檢驗。組內(nèi)相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)性分析法。運用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析miR-142-3p的診斷價值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.兩組PBMC中miR-142-3p表達水平比較：GD組PBMC中miR-142-3p的表達水平(0.378±0.199)較正常對照組(1.104±0.421)明顯降低(P=0.003，圖1)。

圖1 正常對照組與GD組PBMC中miR-142-3p相對表達水平比較

2.miR-142-3P與TT3、TT4、FT3、FT4、TRAb等指標的相關(guān)性分析：分析GD患者PBMC中miRNA-142-3P水平與GD患者臨床資料之間的關(guān)系,miR-142-3P與年齡及性別無明顯相關(guān)性(r=-0.108，P=0.524；r=0.059，P=0.730)；miR-142-3P與TRAb呈負相關(guān)(r=-0.364，P=0.027，圖2)；miR-142-3P與TT4呈負相關(guān)(r=-0.437，P=0.007，圖3)；miR-142-3P與TT3呈負相關(guān)(r=-0.337，P=0.042，圖4)；miR-142-3P與FT3呈負相關(guān)(r=-0.392，P=0.017，圖5)；miR-142-3P與FT4呈負相關(guān)(r=-0.326，P=0.049，圖6)。

圖2 miR-142-3p表達水平與TRAb的相關(guān)性

圖3 miR-142-3p表達水平與TT4的相關(guān)性

圖4 miR-142-3p表達水平與TT3的相關(guān)性

圖5 miR-142-3p表達水平與FT3的相關(guān)性

圖6 miR-142-3p表達水平與FT4的相關(guān)性

3.miR-142-3p診斷效能:ROC分析發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p對GD有一定的診斷價值，ROC曲線下面積(AUC)=0.917(95% CI:0.806～1.028，圖7)，通過ROC曲線確定的miR-142-3p診斷臨界值為0.490，其敏感度為83.8%(95% CI:67.99%～93.81%)，特異性為93.3%(95% CI:68.05%～99.83%)。

圖7 miR-142-3p診斷GD的ROC曲線

討 論

Graves病每年發(fā)生率約為(20～30)/1000000，多在30～60歲發(fā)病[1]。Graves病發(fā)病機制尚未完全闡明，僅證實其是針對甲狀腺濾泡細胞膜上促甲狀腺激素受體(thyroid stimulating hormone receptor，TSHR)產(chǎn)生的抗體(TRAb)所引起的一種自身免疫性疾病。此種抗體是由B淋巴細胞所產(chǎn)生，但其具體作用機制不明，目前主流觀點認為其主要由于抑制性T淋巴細胞功能降低所致，即免疫監(jiān)護和調(diào)節(jié)功能的遺傳性缺陷使患者在遭受精神刺激、感染等應(yīng)激時，體內(nèi)免疫穩(wěn)定性被破壞，B細胞增生，在輔助T細胞的輔助下分泌大量自身抗體(TRAb)而致病[7，8]。

microRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，它能在細胞活動從分裂、增生到凋亡的各個階段皆起到調(diào)控作用，其中在調(diào)控先天免疫及后天免疫中的作用尤為關(guān)鍵，可以通過影響DNA甲基化及TLR信號通道等多個環(huán)節(jié)控制各種免疫細胞亞群的分化[9]。許多研究顯示了不同的miRNA在細胞中的生物學(xué)作用過程，包括細胞增殖，細胞凋亡和通過遷移下調(diào)各種靶向蛋白質(zhì)編碼的表達基因[10，11]。Liu 等[12]首次發(fā)現(xiàn) miRNA的變化在Graves病患者體內(nèi)有重要意義，其利用miRNA芯片技術(shù)評估患者和健康者外周血單核細胞(PBMC)內(nèi)847種人類miRNA的表達，與健康者比較，Graves病患者PBMC內(nèi)表達miRNA差異有意義的有16種，變化最明顯的有miR-154、miR-376b、miR-431和miR-142-3P，該研究利用qRT-PCR技術(shù)檢測GD患者和GD恢復(fù)期PBMC內(nèi)miRNA 的水平，發(fā)現(xiàn)Graves病患者體內(nèi)PBMC中的miR-154、miR-376b、miR-431、miR-142-3p 表達顯著減少。本研究結(jié)果證實了在Graves病患者體內(nèi)PBMC中miR-142-3p表達水平較正常對照組顯著降低，這與其研究結(jié)果一致。

miR-142-3p分布于T細胞，有報道顯示miR-142-3p是潛在的區(qū)分調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)與非Treg的miRNA標記。與正常CD4+T細胞比較，在Treg細胞中miR-142-3p表達水平下調(diào)[13]。Huang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p在T細胞不同亞群中的差異表達介導(dǎo)細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。miR-142-3p通過靶向CD4+CD25-T細胞和CD4+CD25+T細胞中的腺苷酸環(huán)化酶(AC) 9信使RNA負性調(diào)控cAMP的產(chǎn)生。而cAMP在B細胞中為誘導(dǎo)抗原刺激的增生和抗體產(chǎn)生提供了必要的信號[15]。本研究結(jié)果表明，Graves病患者外周血單個核細胞中miR-142-3p的表達水平下調(diào)，而miR-142-3P與TT3、TT4和TRAb呈負相關(guān)。筆者推測miR-142-3p表達下降在甲狀腺功能亢進發(fā)病中的可能機制為：對AC9 mRNA的抑制減弱，導(dǎo)致AC9表達增加，從而使cAMP合成增加，B淋巴細胞增生，從而分泌大量抗體導(dǎo)致GD發(fā)生。

特定的miRNA失調(diào)與人類疾病有關(guān)，包括癌癥、感染性疾病以及和機體免疫反應(yīng)相關(guān)的疾病。這使得它們成為重要的致病因子以及這些疾病的潛在治療目標。結(jié)合本研究結(jié)果，miR-142-3p的表達水平不僅在GD中顯著減少、還與GD患者的血清甲狀腺激素水平高低相關(guān)，筆者認為miR-142-3p也許可以成為Graves病診斷的生物學(xué)標志物和治療新靶點。一般來說，ROC曲線下面積越大，診斷實驗的鑒別能力越強，0.9以上表明診斷價值較高。而miR-142-3P在診斷Graves病中的ROC曲線下面積為0.917，表明miR-142-3p對于Graves病具有較高的診斷價值，當設(shè)置miR-142-3p水平在0.490時，診斷可有較高的敏感度及特異性。臨床中常依據(jù)患者出現(xiàn)高代謝癥狀和體征，甲狀腺明顯腫大及血清TT4、FT4增高，TSH減低，TRAb陽性等可明確GD的診斷。

本研究結(jié)果提示在臨床診斷中可以聯(lián)合現(xiàn)有的指標，使GD診斷體系更加完善、全面而科學(xué)，為某些無明顯臨床表現(xiàn)及血清學(xué)現(xiàn)象的疑難病例診斷提供了一個輔助指標。目前GD的治療主要有抗甲狀腺藥物、131I及手術(shù)治療等，其藥物不良反應(yīng)及術(shù)后并發(fā)癥都較難避免，且GD療程較久容易復(fù)發(fā)。miR-142-3p的表達水平與Graves病相關(guān)，在疾病的發(fā)生、發(fā)展中可能起到重要作用,在治療上也可作為臨床療效判斷的一個標準。進一步研究其作用機制，有望為預(yù)防和治療Graves病提供一個新靶點，增加miR-142-3p的表達可能是GD治療的一種潛在策略，為新藥的開發(fā)提供一個思路。