羥基紅花黃色素A通過 Wnt/β-catenin信號通路抑制卵巢癌生長

龔建明 周瑩巧 林 琪

卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，病死率位居第1位，對女性生命造成嚴(yán)重威脅。盡管目前手術(shù)及化療技術(shù)有一定的改進(jìn)，但復(fù)發(fā)率和耐藥性仍較高。故迫切需要尋找一種有效的抗卵巢癌的藥物。Meselhy等[1]從紅花中分離得到羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A, HSYA)，該成分是紅花活血化瘀的主要有效成分。歷代醫(yī)書均有詳細(xì)記載，已有報(bào)道其對多種瘀血凝結(jié)阻滯型惡性腫瘤均有療效，但其抗癌機(jī)制有待進(jìn)一步研究[2,3]。本研究探討HSYA對體內(nèi)外卵巢癌生長的影響及其機(jī)制，為HSYA治療卵巢癌提供有益的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

1.藥品試劑：CCK-8試劑盒、AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Nuclear β-catenin、menin、MMP7、Survivin抗體購自美國Sigma公司；細(xì)胞核蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；人卵巢癌細(xì)胞株HO-8910PM購自中科院上海細(xì)胞庫；HSYA標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所，取HSYA用0.9%氯化鈉溶液配置成所需的濃度，微孔濾膜過濾除菌，-20℃保存代用。雌性BALB/c裸鼠，8～10周齡，體質(zhì)量18～20g，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及分組：細(xì)胞株HO-8910PM培養(yǎng)在含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱下培養(yǎng)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為兩組，即對照組(以0.9%滅菌氯化鈉溶液處理細(xì)胞株HO-8910PM)和HSYA組(以200μmol/L HSYA作用HO-8910PM 24h)。

3.CCK-8法檢測細(xì)胞增殖：收集處于對數(shù)生長期的HO-8910PM細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種到96孔板，各孔細(xì)胞均勻，過夜貼壁后，分別加入不同濃度HSYA(50、100、200和400μmol/L)，每組3孔，置于37℃培養(yǎng)箱作用24h，同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零組，以及陰性對照組。藥物作用結(jié)束前1h，各孔加入CCK-8溶液0.01ml，繼續(xù)培養(yǎng)1h，酶標(biāo)儀測A450值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A450值-空白調(diào)零組A450值)/(對照組A450值-空白調(diào)零組A450值)×100%。

4.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：將對數(shù)生長期HO-8910PM細(xì)胞(1×106個(gè)/ml)接種在6孔培養(yǎng)板中，HSYA組每孔加入200μmol/L HSYA作用24h，細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，1000r/min離心5min，按試劑盒說明1∶1∶50比例將AnnexinV-FITC、PI、HEPES緩沖液配成染液，每100μl染液重懸1×106個(gè)細(xì)胞，室溫避光培養(yǎng)15min上機(jī)檢測，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm。

5.Western blot法檢測卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞Nuclear β-catenin、menin、MMP7、Survivin蛋白的表達(dá)：收集各組細(xì)胞，加入含有PMSF的細(xì)胞裂解液，提取上清液為細(xì)胞總蛋白。按試劑盒說明書提取細(xì)胞核蛋白。測量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品上樣，于12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳2h，轉(zhuǎn)膜，用10%脫脂奶粉封閉后加入β-catenin抗體、menin抗體、MMP7抗體、Survivin抗體為第一抗體，4℃過夜，再度洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗中，室溫孵育2h，ECL顯色，X線膠片曝光。

6.裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的建立：選擇8～10周齡雌性BALB/c裸鼠，將2×106個(gè)HO-8910PM細(xì)胞懸浮于0.2ml培養(yǎng)基中，注射到裸鼠背部靠近右側(cè)后肢皮下建立裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，接種2周后，挑選出移植瘤體積直徑約10mm的裸鼠。再將這些裸鼠隨機(jī)分為對照組和HSYA組，每組8只，對照組灌胃予0.9%氯化鈉溶液0.2ml/只；HSYA組灌胃予HSYA 50mg/kg，每2天給藥1次，共2周。第8周處死裸鼠留取皮下移植瘤組織。

7.免疫組織化學(xué)法檢測menin、MMP7、Survivin表達(dá)：所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，石蠟切片脫蠟水化后，按照試劑盒所示的操作步驟進(jìn)行染色，在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選擇20個(gè)視野，計(jì)算鏡下陽性細(xì)胞所占比例。

結(jié) 果

1.HSYA對卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞增殖的影響:卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞經(jīng)不同濃度HSYA(50、100、200和400μmol/L)作用24h后，細(xì)胞存活率分別為79.3%、63.7%、49.5%和37.6%，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)；HSYA作用卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞24h后IC50為179.4μmol/L，因此本實(shí)驗(yàn)中選取HSYA最佳濃度為200μmol/L。

2.HSYA對卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞凋亡的影響：200μmol/L HSYA作用HO-8910PM細(xì)胞24h后，誘導(dǎo)10.73%±2.38%的HO-8910PM細(xì)胞凋亡，與對照組(4.91%±0.15%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3.HSYA對卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞內(nèi)Nuclear β-catenin、menin、MMP7、Survivin蛋白表達(dá)的影響：與對照組比較，HSYA組Nuclear β-catenin、MMP7、Survivin蛋白表達(dá)水平均下降(P<0.01，P<0.01，P<0.05)。HSYA組menin蛋白與對照組比較表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01，圖1)。

圖1 HSYA對HO-8910PM細(xì)胞Nuclear β-catenin、menin、MMP7、Survivin蛋白表達(dá)的影響

4.HSYA對裸鼠卵巢癌皮下移植瘤生長的抑制作用：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，仔細(xì)剝離皮下移植瘤組織并稱重，HSYA組腫瘤平均重量為0.66±0.08g，與對照組(1.01±0.18g)比較，瘤重明顯減輕(P<0.01)，抑瘤率為34.7%。

5.HSYA對裸鼠腫瘤組織中menin、MMP7、Survivin表達(dá)的影響:免疫組織化學(xué)染色可見HSYA組腫瘤組織中menin、MMP7和Survivin陽性表達(dá)率分別為43.6%±5.1%、11.9%±2.6%和21.3%±1.8%，對照組腫瘤組織中menin、MMP7和Survivin蛋白陽性表達(dá)率分別為15.3%±2.7%、29.6%±3.8%和56.1%±4.7%；與對照組比較，HSYA組腫瘤組織中MMP7和Survivin陽性表達(dá)率均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；menin陽性表達(dá)率明顯上調(diào)(P<0.01)，詳見圖2。

圖2 HSYA對裸鼠腫瘤組織中menin、MMP7、Survivin表達(dá)的影響(×400)

討 論

HSYA為紅花中提取的活血功效成分，具有活血通經(jīng)，散瘀止痛的作用，有助于局部腫塊的消散及改善微循環(huán)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，有利減少腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散[4,5]。在治療胰腺癌、腸癌、腎癌及宮頸癌等多種惡性腫瘤，均有較多的研究。但在治療卵巢癌方面研究甚少。

在體外實(shí)驗(yàn)中，HSYA能抑制體外卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞的生長，同時(shí)流式檢測凋亡表明HSYA能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，建立起卵巢癌移植瘤模型，觀察到HSYA可顯著抑制卵巢癌移植腫瘤生長。本研究進(jìn)一步闡述HSYA抗卵巢癌機(jī)制的分子機(jī)制，可能與Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)。

Wnt信號通路是一條在進(jìn)化上高度保守的信號途徑，它有著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，對細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、凋亡和壞死等有著重要影響。Wnt/β-catenin信號通路激活時(shí)，β-catenin的定位由胞質(zhì)轉(zhuǎn)為胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP7)、凋亡抑制蛋白(Survivin)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)、原癌基因(C-myc)等基因轉(zhuǎn)錄，這些基因能促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。β-catenin在Wnt信號通路開放的過程中發(fā)揮重要作用，通過檢測細(xì)胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)水平可以判斷Wnt/β-catenin信號通路的激活情況[6]。

menin是多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病1(MEN1)型基因編碼的腫瘤抑制因子，MEN1基因主要分布在細(xì)胞核中，在細(xì)胞質(zhì)中和端粒附近也有分布。有研究表明，menin與Wnt信號通路有密切關(guān)系，menin可以作用于Wnt/β-catenin信號通路中的β-catenin。menin缺失可以導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的聚集以及Wnt信號通路的激活；menin可以通過穿梭運(yùn)動(dòng)對細(xì)胞核內(nèi)的 β-catenin蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)其降解，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)錄活性[7,8]。詳見圖3。本實(shí)驗(yàn)證明，與對照組比較，HSYA組卵巢癌細(xì)胞menin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，Nuclear β-catenin蛋白表達(dá)明顯減少。這表明HSYA可能通過促進(jìn)menin表達(dá)，促進(jìn)β-catenin降解，減少β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的聚集，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)錄活性，實(shí)現(xiàn)其抗卵巢癌機(jī)制。為此，本研究進(jìn)一步檢測HSYA是否抑制卵巢癌細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路下游癌基因MMP-7、Survivin表達(dá)，且MMP-7、Survivin與卵巢癌的惡性程度密切相關(guān)。

圖3 Wnt/β-catenin信號通路

MMP-7又稱為基質(zhì)溶解素，是MMPs家族中結(jié)構(gòu)最小的成員，由腫瘤細(xì)胞及宿主細(xì)胞分泌。它既可有效降解基膜成分，又對血管壁和淋巴管的主要成分-彈性蛋白具有分解作用，在腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。它的表達(dá)也被認(rèn)為是一種腫瘤誘導(dǎo)的宿主反應(yīng)，可以促進(jìn)腫瘤的生長。Shigemasa等[9]研究表明，MMP-7在卵巢黏液性癌組織的表達(dá)比正常組織高。Acar等[10]通過ELISA檢測顯示，MMP-7可作為卵巢癌惡性程度的一個(gè)重要標(biāo)志物。Sillanpaa等[11]通過對卵巢癌組織的檢測及預(yù)后隨訪表明，MMP-7是卵巢癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后預(yù)測因子。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族成員，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的雙重作用，在多種惡性腫瘤組織中，包括白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、宮頸癌、腎癌等組織中Survivin呈異常表達(dá)[12～14]。Survivin的異常高表達(dá)預(yù)示癌癥患者生存率低[15]。許多研究表明，Survivin表達(dá)水平與卵巢癌惡性程度密切相關(guān)，腫瘤的分化程度越低，則Survivin表達(dá)水平越高。Survivin可能通過加快細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)換，抑制G1期靜止，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，增強(qiáng)其遷移侵襲能力，進(jìn)而促進(jìn)相應(yīng)腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HSYA組卵巢癌細(xì)胞MMP-7、Survivin蛋白水平均下降，免疫組化結(jié)果顯示HSYA亦能抑制MMP-7、Survivin蛋白在體內(nèi)卵巢癌組織中的表達(dá)。表明HSYA能抑制MMP-7、Survivin在體內(nèi)外卵巢癌細(xì)胞中過度表達(dá)，發(fā)揮抗癌作用。HSYA可能通過促進(jìn)menin表達(dá)，減少β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的聚集，其下游的癌基因MMP-7、Survivin表達(dá)亦減少，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的生長。

圖4 HSYA作用機(jī)制模式圖

綜上所述，HSYA可能通過促進(jìn)menin表達(dá)，導(dǎo)致β-catenin降解，減少β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的聚集，抑制Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)錄活性，減少下游的癌基因MMP-7、Survivin表達(dá)，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞的生長，促進(jìn)其凋亡(圖4)。本研究為臨床上應(yīng)用HSYA治療卵巢癌提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，有一定的臨床意義。