用1H-MRS評價利拉魯肽對肥胖小鼠脂質代謝影響的研究

辛 穎 閆 爽

肥胖作為一種由遺傳、環(huán)境、腸道菌群等多種因素作用的慢性代謝性疾病，目前已呈全球流行趨勢。最新研究資料顯示,截至2015年，全球約有22億超重/肥胖患者，中國達5700萬，僅次于美國，位居世界第2位[1]。大量研究證實，肥胖與糖尿病、心血管疾病、腫瘤等慢性疾病的發(fā)生和死亡密切相關。因此，治療肥胖癥及其相關的健康問題對衛(wèi)生保健系統(tǒng)具有重大的影響[2～4]。

哺乳動物體內有棕色脂肪組織 (brown adipose tissue, BAT)、白色脂肪組織 (white adipose tissue, WAT)和米色脂肪組織(beige adipose tissue，BAT) 3種。肥胖主要表現為白色脂肪數量的增多和體積的增大，并聚集于腹腔和皮下，以甘油三酯(triglyceride,TG)的形式儲存過剩的能量[5]。甘油三酯在脂肪組織與非脂肪組織等部位的過度蓄積，可導致脂肪組織缺氧、慢性炎性反應以及脂肪因子分泌破壞，繼發(fā)全身胰島素抵抗與脂質代謝紊亂,因此而誘發(fā)糖尿病、非酒精性脂肪肝病(NFALD)等[6,7]。

利拉魯肽作為一種人工合成的胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide -1,GLP-1)的類似物，因其獨有的促胰島素分泌(葡萄糖濃度依賴性)、改善胰島β細胞功能等特性，目前廣泛應用于2型糖尿病的治療[8]。近年來，利拉魯肽作為一種減重藥物為人們所熟知。因GLP-1受體廣泛分布在人體的各個部位，包括胰腺、胃、十二指腸、肺、心臟、肝臟、腎臟、腦及內皮細胞等[9]。而利拉魯肽可通過與分布于腦干、下丘腦和杏仁體的GLP-1受體結合，發(fā)揮中樞性抑制食欲作用，同時抑制胃腸蠕動及分泌功能，延緩胃內容物排空，從而達到減重的效果[10]。2014年美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration of the United States,FDA)批準利拉魯肽用于慢性體重管理，利拉魯肽3.0mg/d成為肥胖人群尤其伴有高血壓、糖尿病、血脂代謝異常人群減重的輔助治療手段[11]。最近的大量臨床研究和動物實驗還證實了GLP-1可通過減輕體重，改善胰島素抵抗和糖代謝，進而改善肝臟脂質沉積[12]。間斷性禁食(intermittent fasting，IF)是一種新型的通過飲食干預減重的方法，主要包括5∶2飲食及隔日禁食，本研究采用隔日禁食(alternate day fasting，ADF)的方式，即正常飲食1日，然后禁食1日，如此循環(huán)[13]。

本研究采用氫質子磁共振波譜成像(proton magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS)技術，經病理對照研究證實，1H-MRS不僅是活體下測量體內TG含量最準確、最可靠的影像學手段，還是對非酒精性脂肪肝定性和定量有效的方法[14,15]。本研究主要對C57BL6小鼠進行高脂肥胖小鼠造模，探討利拉魯肽的減重效果，及對小鼠體內不同部位、不同性質脂肪內甘油三酯含量的變化情況，以及與嚴格飲食控制即隔日禁食法干預比較，利拉魯肽對脂肪組織代謝的影響是否完全依賴于體質量減輕。

材料與方法

1.材料：SPF級C57BL6雄性小鼠 32只, 6周齡，體質量約23±10g,購自北京維通利華實驗動物中心。利拉魯肽(諾和力) 購自丹麥諾和諾德公司;小動物9.4T MR購自德國Bruker PharmaScan公司；小鼠正常飼料D12492、高脂飼料D12450B購自博泰宏達生物有限公司。

2. 實驗方法:(1)肥胖小鼠模型建立及干預:將6周齡清潔級C57BL6雄性小鼠32只,隨機分為4組，每組8只，其中一組給予正常飼料(D12450B，10kcal%脂肪)喂養(yǎng)，其余3組給予高脂飼料(D12492，60kcal%脂肪)喂養(yǎng)，進行肥胖小鼠造模。8周后，與正常飼料喂養(yǎng)組比較，高脂飼料喂養(yǎng)組平均體質量增長超過30%，提示肥胖小鼠造模成功。將成功造模后的高脂飼料喂養(yǎng)組隨機分為利拉魯肽(GLP-1)組、隔日禁食(ADF)組和高脂對照(HFD)組, GLP-1組和HFD組分別繼續(xù)給予高脂飲食，ADF組與正常對照(Control)組給予普通飼料喂養(yǎng)。GLP-1組每日皮下注射利拉魯肽 0.4mg/(kg·d)，ADF組為每隔24h給予正常飼料，期間自由飲水。所有小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，標準鼠籠飼養(yǎng),每籠4～5只,溫度 20～25℃,濕度50%～60%，動物室內明暗各12h左右。(2)1H-MRS測定肩胛間區(qū)棕色脂肪、腹股溝區(qū)白色脂肪及肝臟內甘油三酯(triglyceride, TG)含量:每組小鼠8只,4組共32只，掃描晨起禁食, 所有1H-MRS采集均在9.4 T MicroMR成像設備(Bruker PharmaScan，德國)上完成。掃描期間采用吸入麻醉劑異氟烷，與氧氣混合后誘導劑量為5%，維持劑量為1%～2%，同時連接呼吸門控監(jiān)視呼吸節(jié)律及幅度，呼吸頻率保持25～35次/分，并予以保溫。采集1H-MRS運用點分辨自旋回波波譜技術(point-resolved echo spin spectroscopy，PRESS)，體素為1.5mm×1.5mm×1.5mm～3.0mm×3.0mm×3.0mm，先取俯臥位，體將表面線圈至于肩胛間區(qū)，再取仰臥位，將表面線圈置于下腹部生殖腺周圍及肝臟左葉，避開大血管部位。波譜數據分析時，設定4.7ppm位置水峰下面積為1，所有其他峰的積分值都隨之標準化，甘油三酯(triglyceride,TG)峰位于1.2ppm處。按下列公式計算脂肪含量： TG含量=TG峰下面積/(水峰下面積+TG峰下面積)×100%。

結 果

1.4組小鼠體質量隨時間變化趨勢比較：干預前各組小鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義，隨喂養(yǎng)時間的延長，各組小鼠平均體質量均呈明顯升高的趨勢(P<0.05)，詳見圖1。干預16周末，GLP-1組小鼠平均體質量明顯低于HFD組(P=0.009)，而高于對照組(P=0.011)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。4組小鼠干預16周后，ADF組小鼠平均體質量最低，詳見圖2、表1。

圖1 4組小鼠造模及干預期間體質量變化

圖2 干預16周末4組小鼠體質量比較

表1 干預16周末4組小鼠體質量及1H-MRS下各部位TG含量比較

與HFD組比較,*P<0.05;與ADF組比較,ΔP<0.05

2.4組小鼠肩胛部棕色脂肪TG平均含量：由低到高分別是對照組，ADF組，GLP-1組和HFD組；各組間比較差異有統(tǒng)計學意義，詳見表1、圖3。

圖3 干預16周末4組小鼠肩胛間區(qū)棕色脂肪TG含量比較

3.肝臟TG含量：4組小鼠肝臟TG平均含量由低到高分別是對照組， GLP-1組，ADF組和HFD組，GLP-1組和HFD組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.045)，詳見表1、圖4。

圖4 干預16周末4組小鼠肝臟TG含量比較

4.腹股溝部位白色脂肪TG含量：4組小鼠腹股溝白脂肪TG平均含量由低到高分別是對照組，ADF組， GLP-1組和HFD組，與GLP-1組小鼠比較，對照組小鼠腹股溝白脂肪TG平均含量明顯降低(P=0.002)，HFD組小鼠腹股溝白脂肪TG平均含量明顯升高(P=0.015)，詳見表1、圖5。

圖5 4組小鼠肝臟部位1H-MRS圖像

圖6 干預16周末4組小鼠腹股溝區(qū)白色脂肪TG含量比較

討 論

目前隨著全球肥胖人群的不斷增長，肥胖的預防和控制越來越受到人們的關注。肥胖所引發(fā)的胰島素抵抗、血脂代謝異常、慢性炎性反應是其引起的相關慢性疾病發(fā)生及發(fā)展的重要原因。甘油三酯(TG)在體內沉積部位包括脂肪組織與非脂肪組織(如肝臟)兩部分，因此脂肪組織可與肝臟相互聯(lián)系，通過調節(jié)游離脂肪酸水平，合成與釋放多種脂肪細胞因子來控制全身的脂質代謝[16]。

利拉魯肽作為一種人工合成的GLP-1受體激動劑，與人體內GLP-1的同源性達97%，目前研究表明人體內GLP-1可抑制攝食中樞，延緩胃排空，從而達到抑制甘油三酯吸收的效果，因此人體內GLP-1在減低體重的同時可改善脂質代謝[17]。關于人工合成GLP-1受體激動劑的研究亦表明，GLP-1受體激動劑可能通過抑制脂肪的合成及刺激脂肪酸氧化兩個方面來改善肝臟的脂質代謝[18]。雖然目前大量研究結果表明GLP-1可影響體內脂肪酸代謝，然而機制仍未完全明確。

自2010年Gupta等首次發(fā)現人類原代肝細胞上存在GLP-1受體,之后陸續(xù)有臨床、動物及細胞研究證明了GLP-1能改善脂質在肝臟內的沉積,但具體機制尚不明確。研究發(fā)現，作為介導細胞間黏附和參與基因表達的β-catenin分子對GLP-1的生成和功能發(fā)揮起著重要作用，其重要機制除了包括wnt信號途徑外，還可能與遷移相關信號通路PI3K/Akt、MAPKs之間存在密切關系。β-catenin作為wnt信號途徑的核心分子，越來越多的研究表明，其與肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪性肝病以及代謝綜合征的發(fā)生、發(fā)展也密切相關。雖然GLP-1降脂機制仍不十分清楚，但其降脂效果得到了公認，本研究意在通過小鼠高脂模型研究GLP-1對小鼠機體不同部位脂肪含量的影響，驗證其通過多途徑影響脂代謝的假說。

本研究通過對C57BL6小鼠建立肥胖模型，以FDA建議的3.0mg/d的減重劑量換算成小鼠給藥劑量0.4mg/(kg·d)，并分別設置普通對照組，高脂對照組及隔日禁食組，隔日禁食組被動性減少小鼠攝食量，導致小鼠攝入的能量顯著降低，從而達到強制性減重的目的。干預16周末，通過1H-MRS技術分別對4組小鼠進行掃描，測量定量肩胛部位棕色脂肪，腹股溝區(qū)白色脂肪及肝臟等3個部位的甘油三酯含量。

本研究結果顯示，利拉魯肽有顯著降低體質量及改善白色脂肪脂質代謝的作用，但通過與隔日禁食組比較后發(fā)現，額外的體質量減低并沒有給隔日禁食組帶來白色脂肪脂質代謝方面的獲益，這說明利拉魯肽在通過降低體質量改善脂質代謝的同時，還有其他不依賴于體質量減輕而影響脂質代謝的途徑。有研究顯示，GLP-1受體激動劑可能通過MAPK通路，促進脂肪酸氧化，逆轉肝臟脂肪變性，還可能通過增強肝細胞自噬作用，減少肝臟脂肪沉積，并通過增加沉默調節(jié)蛋白(SIRT1)的表達，抑制肝細胞內質網應激，減少肝臟脂質沉積[19，20]。近年來研究發(fā)現，哺乳類動物和嚙齒類動物的肝臟上均存在 GLP-l受體[21]。因此，筆者認為利拉魯肽改善肝臟脂質代謝是一個多途徑、多通路的復雜的過程，不單純依賴于體重的減輕，但這一過程還需要更多的基礎性研究加以佐證。