FOXQ1與E-cadherin蛋白在口腔鱗癌中的表達及臨床意義

閆 冰 樸松林 楊海燕 元冬梅 沈禹辰 李吉辰

口腔頜面部惡性腫瘤是全球范圍內10種最常見的腫瘤之一，其中以口腔鱗狀細胞癌所占比例最高，約為90%以上[1]。在過去的幾十年里，口腔鱗癌的發生率呈明顯的上升趨勢[2]。轉錄因子叉頭框Q1(forkhead box Q1，FOXQ1)廣泛存在于人體的多種組織和器官，具有促進上皮分化、參與細胞周期調節等多種生理功能，并與人類腫瘤的發生、發展和轉移關系密切，但目前FOXQ1在口腔鱗癌中的表達情況及作用尚未明確[3]。上皮鈣黏蛋白(epitheia cadherin，E-cadherin)目前被公認為是一類抑癌因子，其表達水平降低或缺失可作為腫瘤細胞出現上皮-間質轉化(EMT)的一個關鍵性特征，與多種腫瘤的侵襲與轉移具有相關性[4]。本研究通過免疫組化染色法檢測FOXQ1和E-cadherin的表達情況，分析兩者之間的相關性，探究兩者在口腔鱗癌中的作用及臨床意義。

對象與方法

1.實驗對象:收集2013年4月～2016年10月間哈爾濱醫科大學第一臨床醫學院病理科已確診的口腔鱗癌組織石蠟標本作為研究對象。根據WHO病例分型,其中高分化口腔鱗癌51例，中、低分化口腔鱗癌18例，共69例，其中，男性39例，女性30例，患者年齡38～80歲，中位年齡為57歲。根據國際抗癌聯盟(UICC)制定的TNM分類分期標準(2010)對臨床分期進行分類：Ⅰ～Ⅱ期46例，Ⅲ～Ⅳ期23例。納入本研究中的所有口腔鱗癌患者均已行手術治療，且術前均未接受過放、化療等相關治療。從口腔頜面外科手術切取的唇、舌、牙齦、頰部及口底來源共32例正常口腔黏膜組織石蠟標本作為對照組。兩組常規資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本實驗已獲得患者及家屬的知情同意。

2.主要試劑：FOXQ1兔抗人多克隆抗體、E-cadherin兔抗人多克隆抗體、免疫組化試劑盒以及DAB顯示劑盒等均購自北京博奧森生物技術有限公司。

3.實驗方法：本實驗應用SP方法，所有標本按4μm厚度作連續切片。將組織石蠟切片置于67℃烤箱中烤90min，脫蠟，PBS沖洗3min×3次。放置于3%H2O2室溫下孵育10min，PBS 沖洗3min×3次。PBS浸泡5min。將切片浸泡于EDTA緩沖液，高壓蒸汽鍋行抗原修復，待壓力鍋噴氣時，計時3min后于室溫下自然冷卻。PBS沖洗5min×3次。滴加FOXQ1多克隆抗體(1∶100)及E-cadherin多克隆抗體(1∶100)，于4℃恒溫環境下過夜，蒸餾水沖洗5min 后，PBS沖洗3min×3次；滴加二抗工作液，37℃孵育30min；蒸餾水沖洗3min后，PBS 沖洗3min×3次；DAB試劑盒顯色，蒸餾水沖洗終止顯色反應。蘇木精復染，蒸餾水充分沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。

4.結果判讀：FOXQ1在口腔鱗癌組織中的陽性表達為細胞質被染出棕黃色顆粒，少量細胞核中表達。E-cadherin在正常口腔黏膜組織中的陽性表達為細胞膜與胞質被染出棕黃色顆粒。每張切片高倍鏡下(×400)隨機觀察5個不重疊視野，每個視野各計200個細胞。采用雙盲法，根據陽性腫瘤細胞率進行半定量分析，陽性細胞率以≤10%、10%～50%(含)、50%～80%、≥80%分別記為0、1、2、3分；根據染色程度進行評分：無染色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0、1、2、3分；結果按兩者的得分之積來判定結果：<3分計為陰性(-)，≥3分計為陽性(+)。

5.統計學方法：應用SPSS 20.0統計學軟件對數據進行統計分析，采用χ2檢驗處理計數資料，Spearman法行等級相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.FOXQ1與E-cadherin在口腔鱗癌及正常口腔黏膜組織中的表達比較:FOXQ1在口腔鱗癌中的表達位置主要為細胞質，可見癌細胞被染成棕黃色至棕褐色，少見細胞核表達，而在正常口腔黏膜組織中表現為表達減少甚至缺失。E-cadherin在正常口腔黏膜組織中的表達位置主要為細胞膜與細胞質中，亦都被染成棕色，而在口腔鱗癌組織中低表達或不表達(圖1)。FOXQ1在口腔鱗癌組織中陽性表達率為71.01%(49/69)，E-cadherin則為27.53%(19/69)，正常口腔黏膜組織中陽性表達率分別為18.75% (6/32)、84.37% (27/32)，兩者間比較差異有統計學意義(P<0.01),詳見表1。

圖1 FOXQ1和E-cadherin在口腔鱗癌及正常口腔黏膜組織中的表達比較(×400)A.FOXQ1在正常口腔黏膜組織中的表達；B.FOXQ1在高分化口腔鱗癌組織中的表達；C.FOXQ1在中分化口腔鱗癌組織中的表達；D.FOXQ1在低分化口腔鱗癌組織中的表達；E.E-cadherin在正常口腔黏膜組織中的表達；F.E-cadherin在高分化口腔鱗癌組織中的表達；G.E-cadherin在中分化口腔鱗癌組織中的表達；H.E-cadherin在低分化口腔鱗癌組織中的表達

表1 FOXQ1與E-cadherin在口腔鱗癌及正常口腔黏膜組織中的表達

與正常口腔黏膜組織比較，*P<0.01

2.口腔鱗癌組織中FOXQ1及E-cadherin的表達與臨床病理參數的關系:在口腔鱗癌組織中，FOXQ1的表達與患者的年齡、性別、吸煙史及腫瘤直徑無明顯相關性(P>0.05)，與口腔鱗癌的組織分化程度及TNM分期呈正相關(P<0.05)，E-cadherin的表達與上述結論一致，詳見表2。

表2 FOXQ1與E-cadherin的表達與口腔鱗癌臨床病理參數的關系

3.口腔鱗癌組織中FOXQ1與E-cadherin表達的相關性:FOXQ1陽性表達的49例口腔鱗癌組織標本中，E-cadherin陽性表達為10例，陰性表達為39例；FOXQ1陰性表達的20例口腔鱗癌組織標本中，E-cadherin陽性表達為9例，陰性表達為11例。以Spearman法行等級相關性分析，口腔鱗癌組織中FOXQ1與E-cadherin的表達呈明顯負相關(r=-0.250，P<0.05),詳見表3。

討 論

FOXQ1屬于叉頭框(forkhead box，FOX)轉錄因子家族中的一員。FOXQ1基因位于人類染色體6p25.3，由2319個堿基對(bp)組成，FOXQ1蛋白含有403個功能氨基酸[11]。FOXQ1通過作用于靶基因啟動子區域的GC盒等核心元件，影響基因轉錄從而發揮生物學效應。以往的研究證實FOXQ1的過度表達與肝細胞癌、肺癌、胃癌、結腸癌、宮頸癌和食管鱗癌等多種癌癥的不良預后和遠處轉移密切相關[12～17]。Gao等[18]以FOXQ1高表達的人卵巢癌細胞系SKOV3為模型，利用shRNA敲除方法沉默FOXQ1的表達后發現細胞周期調節因子的表達受到影響，并使上皮細胞標志物上調、間充質細胞標志物下調，導致其腫瘤細胞生長周期出現減緩現象，從而抑制細胞增殖，減少細胞運動與侵襲，這些結果提示FOXQ1的表達對維持卵巢癌細胞的增殖、運動、侵襲和EMT是必不可少的。

表3 FOXQ1與E-cadherin在口腔鱗癌組織中表達的相關性

Zhang等[19]和Fan等[20]研究發現,FOXQ1的異位表達促進了細胞在體外的遷移和侵襲，增強了乳腺上皮細胞在體內的肺轉移，并觸發了明顯的EMT，其作用機制可能為FOXQ1蛋白直接作用于E-cadherin的啟動子區域，從而抑制E-cadherin的表達，并參與了TGF-b1誘導的EMT過程。Qiao等[21]研究發現FOXQ1在多種結腸癌細胞株中的異位表達不僅能誘導EMT的發生，并能誘導這些細胞產生化療藥物耐藥性。Zhan等[22]研究結果顯示，FOXQ1在胰腺癌組織中的表達上調，其主要在胰腺癌細胞質中表達，在細胞核中表達較少。胰腺癌組織中FOXQ1表達水平顯著高于癌旁組織，并與腫瘤分化程度呈正相關，這也與筆者的實驗結果相一致。本研究中FOXQ1在口腔鱗癌組的陽性表達率與對照組差異有統計學意義(71.01%、18.75%，P<0.01)，初步推斷FOXQ1在口腔鱗癌中扮演著重要角色。FOXQ1與口腔鱗癌的組織分化程度及TNM分期相關則提示其在口腔癌的發展中起到一定作用。

腫瘤細胞向遠處器官轉移是人類腫瘤最常見的死亡原因。上皮-間充質轉化(EMT)是一個促進細胞遷移和侵襲的動態過程。上皮細胞可喪失極性轉化為間質細胞表型，細胞黏附性連接中斷，從而使腫瘤細胞具備了遷移和侵襲能力，引起腫瘤的遠處轉移[5]。因此，EMT相關轉移是腫瘤研究的一個重要領域。E-cadherin是一類鈣依賴性跨膜糖蛋白，其N-端位于細胞外而C-端位于細胞內，其編碼基因(CDH1)位于人類染色體6q22.1[6，7]。E-cadherin可以介導同種上皮細胞之間的黏附作用，起著維持上皮組織結構完整的重要作用[8]。如果E-cadherin在組織中失活或是表達水平降低，細胞間的黏附力會明顯下降，進而有利于腫瘤細胞的侵襲與轉移。反之，若E-cadherin 在組織中的表達水平升高可增強細胞間的黏附，腫瘤細胞的侵襲力被減弱，抑制其浸潤轉移[9]。EMT的一個標志性特征是E-cadherin的表達抑制，E-cadherin也被認為是EMT的關鍵開關[10]。本研究中E-cadherin在正常黏膜組織中的陽性表達率為84.37%，但僅有27.53%口腔鱗癌標本呈陽性表達，兩者之間比較差異有統計學意義(P<0.01)，提示E-cadherin與口腔鱗癌的侵襲與轉移有關。

綜上所述，在口腔鱗癌的發病過程中，FOXQ1呈高表達水平，而E-cadherin的表達情況則呈相反趨勢，二者呈明顯負相關(r=-0.250，P<0.05)，FOXQ1與E-cadherin共同參與口腔鱗癌的發展和轉移。因此，FOXQ1與E-cadherin的聯合檢測可作為口腔鱗癌早期診斷及判斷預后的生物學指標，FOXQ1有望成為口腔鱗癌治療的新靶點。但FOXQ1和E-cadherin二者在口腔鱗癌中的作用機制尚需開展進一步探究。