AAV6-hNGFβ轉染對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用與PI3K/Akt信號通路的關系

羅 荔 張 潔 張 麗 李曉嵐

臨床上缺血性腦損傷(cerebral ischemia injury)較常見，包括動脈粥樣硬化引發的局灶性腦缺血、心跳驟停引發的全腦缺血等，腦卒中具有高發生率和高復發率，已成為世界第2常見死亡原因和主要致殘原因[1]。神經生長因子(nerve growth factor, NGF)是一種非常重要的活性因子，近年來有研究發現，在腦缺血再灌注動物模型中，內源性NGF mRNA表達會顯著增加，從而產生神經保護和修復作用，減輕腦缺血再灌注損傷[2]。在細胞的分化、增殖和凋亡等生命周期活動中，PI3K/Akt信號通路可以發揮調節作用，是一條十分重要的細胞通路[3]。PI3K/Akt信號通路中蛋白激酶B(Akt)磷酸化后處于活化狀態，可以激活許多細胞保護調節機制[4]。本研究基于腦缺血再灌注大鼠模型，通過轉染AAV6-hNGFβ后檢測NGF、Akt、p-Akt、Bcl-2和Bax等蛋白及mRNA水平改變，探討轉染AAV6-hNGFβ減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷作用與PI3K/Akt信號通路的關系，為腦缺血再灌注的治療提供分子生物學依據。

材料與方法

1.實驗動物及分組： 12周齡雄性SD大鼠72只，體質量250～300g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供,實驗動物許可證號：XJMU201700314。實驗期間動物飼養于新疆醫科大學動物房，每日光照約12h，自由飲食和飲水。為避免實驗環境的改變對大鼠的影響，所有大鼠飼養2周后進入實驗。72只SD大鼠隨機方法分為4組(n=18)，即假手術(sham)組、腦缺血再灌注(I/R)模型組、hNGFβ(I/R模型組+AAV6-hNGFβ-EGFP)組和陰性對照(I/R模型組+AAV6-EGFP)組，腦缺血再灌注模型成模后，模型組大鼠經股靜脈注射0.3ml 0.9%氯化鈉注射液，hNGFβ組大鼠股靜脈單次注射0.3ml攜帶hNGFβ-EGFP基因的腺相關病毒(2×1010TU/ml)，陰性對照組大鼠股靜脈單次注射0.3ml攜帶EGFP(綠色熒光蛋白)基因的腺相關病毒(2×1010TU/ml)，各組注射1周后取材進行腦組織熒光顯色。

2.材料： hNGFβ過表達腺相關病毒AAV6-hNGFβ(中國上海吉瑪制藥技術有限公司)，水合氯醛、多聚甲醛(中國成都科龍化工試劑廠)，Akt、p-Akt、NGF、Bcl-2和Bax抗體(美國CST公司)，TUNEL 凋亡檢測試劑盒、反轉錄酶和熒光定量PCR試劑(中國上海生工生物工程有限公司)。

3.腦缺血再灌注模型的建立： 參照Longa法復制大鼠局灶性腦缺血再灌注動物模型[5]。大鼠用10%水合氯醛麻醉后，分離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，將制備好的線栓插入頸總動脈，推進約18～20mm，遇到阻力即可停止，阻斷2h后，緩慢撥出線栓，扎緊動脈殘端，逐層縫合組織和皮膚，缺血再灌注損傷模型制備成功。假手術組除不插線栓外，其余步驟同上。術后按照改良的神經功能缺損評分(modified neuro-logical severity scores，mNSS)進行評價，對動物進行運動實驗、感覺實驗(視覺、觸覺和本體感覺等)、橫桿平衡實驗和反射檢查，正常為0分，最高分為18分，分值越高神經系統損傷越嚴重。

4.腦梗死面積測定： 分別在1、2、4周對各組大鼠進行腦梗死面積的測定，每組6只，經水合氯醛麻醉后，迅速開胸進行心臟灌流，灌流后快速斷頭取腦，洗凈后將腦組織在-20℃冰箱里冷凍20min，以2mm間距冠狀切成5～6片，用2%的TTC磷酸鹽緩沖液37℃避光染色30min，然后進行4%多聚甲醛固定24h，采用醫用計算機彩色圖像分析系統計算梗死體積。

5.免疫組化和TUNEL凋亡細胞檢測： 用免疫組化方法檢測NGF、Bcl-2、Bax和p-Akt的表達。石蠟切片常規二甲苯，乙醇脫蠟至水，水洗后分別滴加相應一抗，4℃靜置過夜，HRP標記的二抗孵育30min，DAB顯色后蘇木精復染，常規脫水、透明、樹脂封片，鏡下觀察，細胞核呈紫藍色，陽性產物呈棕黃色或黃色。使用TUNEL 凋亡試劑盒進行凋亡細胞檢測，按說明書中鏈霉抗生物素蛋白(SABC)步驟染色，石蠟切片經常規脫蠟，至水，蛋白酶K消化，TdT酶和DIG-dUTP混合液孵育2h，生物素偶聯抗地高辛抗體孵育2h，SABC孵育2h，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，封片，細胞核出現棕黃色顆粒為凋亡細胞。

6.Western blot法檢測： 收集各實驗組大鼠腦組織，勻漿處理后抽提總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電轉到硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗后4℃孵育過夜，然后加入二抗室溫孵育1h后顯色曝光。采用圖像分析軟件Image J分析目的條帶，分別計算目的條帶與內參的灰度值，用兩者比值表示目的蛋白的相對表達強度。

7.反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測： 收集各實驗組大鼠腦組織，總RNA 的提取及熒光定量PCR參照試劑說明書進行實驗。

結 果

1.轉染效率觀察及腦缺血再灌注后神經功能評分比較： 大鼠腦缺血/再灌注術造模成功，治療組和陰性對照組分別注射AAV6-hNGFβ-EGFP和AAV6-EGFP 1周后，熒光顯微鏡下觀察腦組織神經元細胞中開始有綠色熒光表達，轉染效率較高，其余各組則無熒光(圖1)。治療組開始注射AAV6-hNGFβ-EGFP后1、2和4周，神經功能評分同模型組及陰性對照組(模型組+AAV6-EGFP)比較，均出現明顯降低(P<0.05，P<0.01)，結果見表1。

圖1 大鼠腦組織神經元綠色熒光表達(×200)A.陰性對照組; B.hNGFβ組

表1 各組大鼠神經功能評分比較

與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較,#P<0.05；與陰性對照組比較,△P<0.01

2.各組大鼠腦梗死體積比較：圖2的TTC染色結果顯示腦缺血再灌注損傷4周后腦梗死情況，除假手術組外其余各組均可見白色梗死部分。與假手術組比較，模型組大鼠的腦梗死體積明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組及陰性對照組比較，hNGFβ組腦梗死體積明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。模型組與陰性對照組比較，腦梗死體積差異無統計學意義(P>0.05，圖3)。

圖2 各組大鼠腦組織TTC染色A.假手術組; B.模型組; C.陰性對照組; D.hNGFβ組

圖3 各組大鼠腦梗死體積比較與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較,#P<0.05；與陰性對照組比較,△P<0.01

3.免疫組化檢測NGF、p-Akt、Bcl-2和Bax表達變化： 假手術組大鼠腦組織皮質區NGF表達較多，p-Akt表達較少；造模成功后4周，與假手術組比較，模型組和陰性對照組皮質區NGF表達減少，p-Akt表達增加；hNGFβ組轉染AAV6-hNGFβ-EGFP 4周后，與模型組和陰性對照組比較，大鼠腦組織皮質區NGF表達顯著升高，p-Akt表達也明顯增加(圖3)，Akt的磷酸化水平增強。另一方面，與假手術組比較，模型組大鼠皮質區Bcl-2蛋白表達顯著減少，Bax表達明顯增強；hNGFβ組轉染AAV6-hNGFβ-EGFP 4周后，與模型組和陰性對照組比較， Bcl-2表達顯著增加，Bax表達明顯減少。

圖4 大鼠腦皮質區NGF、p-Akt、Bcl-2和Bax免疫組化染色(×200)A.假手術組; B.模型組; C.陰性對照組; D.hNGFβ組

4.TUNEL凋亡細胞檢測： 與假手術組比較，模型組大鼠的腦組織內神經元細胞出現棕褐色顆粒，不規則形態的凋亡神經元數量明顯增加；與模型組及陰性對照組比較，hNGFβ組神經元細胞核染色變淺，凋亡細胞明顯減少。模型組與陰性對照組比較，凋亡神經元數量接近(圖5)。

5.轉染AAV6-hNGFβ-EGFP對大鼠腦缺血再灌注后Akt磷酸化水平的影響： 收集各組大鼠腦組織，采用qPCR法和Western blot法檢測腦組織皮質區不同病程(1、2、4周)NGF、Akt和p-Akt的mRNA和蛋白表達水平。與假手術組比較，腦缺血再灌注損傷發生后，模型組和陰性對照組大鼠腦組織NGF的mRNA和蛋白表達明顯減少，Akt的mRNA表達水平顯著升高，p-Akt蛋白表達顯著增強，Akt磷酸化水平(p-Akt/Akt)明顯升高(P<0.01，圖6)。hNGFβ組轉染AAV6-hNGFβ-EGFP后，與模型組和陰性對照組比較，大鼠腦組織NGF的mRNA和蛋白表達顯著增強，Akt的mRNA表達顯著升高，p-Akt表達也明顯增加，Akt的磷酸化水平顯著提升(P<0.01)，見圖6。

圖5 TUNEL檢測凋亡細胞(×400)A.假手術組; B.模型組; C.陰性對照組; D.hNGFβ組

6.轉染AAV6-hNGFβ-EGFP對大鼠腦缺血再灌注后Bcl-2和Bax表達影響： 收集各組大鼠腦組織，采用qPCR和Western blot法檢測腦組織皮質區不同病程(1、2、4周)Bcl-2和Bax的表達水平。Bcl-2和Bax的qPCR和Western blot法檢測結果如圖6所示，與假手術組比較，模型組Bcl-2的mRNA和蛋白表達顯著減少(P<0.01)，Bax的mRNA和蛋白表達顯著升高(P<0.01)，模型組和陰性對照組中，Bcl-2和Bax的mRNA及蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，hNGFβ組Bcl-2的mRNA和蛋白表達表達顯著升高(P<0.01)，Bax的mRNA和蛋白表達顯著減少(P<0.01)。

圖6 大鼠腦皮質區NGF、Akt和p-Akt的mRNA和蛋白表達變化A.NGF mRNA變化; B.NGF蛋白變化; C.Akt mRNA變化; D.p-Akt蛋白變化; 與假手術組比較, *P<0.01，**P=0.000;與模型組比較,#P<0.05，##P<0.01;與陰性對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01

圖7 大鼠腦皮質區Bcl-2和Bax的mRNA和蛋白表達變化A.Bcl-2 mRNA變化; B.Bcl-2蛋白變化; C.Bax mRNA變化; D.Bax蛋白變化; 與假手術組比較, *P<0.01，**P=0.000；與模型組比較，#P<0.01;與陰性對照組比較，△P<0.01

討 論

大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型不需開顱，對腦損傷較小，腦病變范圍與人體相近，部位恒定，梗死率高，是最常用的局灶性腦缺血動物模型[5]。模型制備完成后，可通過改良神經功能缺損評分和腦梗死體積對模型進行評價。本研究在腦缺血再灌注損傷大鼠體內注射AAV6-hNGFβ-EGFP，進行基因治療，使合成產物 hNGFβ得到高表達，從而減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。實驗結果表明，治療組開始注射AAV6-hNGFβ-EGFP后，神經功能評分同模型組與陰性對照組比較，均出現明顯降低。此外，大鼠的腦梗死體積計算結果也表明，轉染AAV6-hNGFβ-EGFP可以減少大鼠腦缺血再灌注損傷后的腦梗死體積。目前以改變細胞遺傳物質為基礎的基因治療已得到廣泛應用，席聰等[6]在I/R大鼠中注射rAAV-PR39-ADM過表達抗菌肽(PR39)和腎上腺髓質素(ADM)后，可改善大鼠腦缺血再灌注后局部供血，促進血管再生，保護神經元，減輕腦缺血再灌注損傷。

腦缺血再灌注損傷機制較復雜，包括細胞內鈣超載、自由基生成及高能磷酸化合物缺乏等[7～9]。在腦缺血再灌注程中，能保護神經細胞的因子減少，損害神經細胞的因子增多(如氧自由基、炎性和凋亡因子等)，從而嚴重影響腦缺血性腦卒中患者的愈后，而保護神經元細胞并減少其凋亡，可以防止腦卒中引起的神經功能障礙[10～12]。作為神經營養因子家族(NTFs)中一種非常重要的活性因子，NGF在腦內主要來源于神經元和膠質細胞。腦缺血性損傷發生后，NGF不僅可以保護和減少神經元損傷，還可以促進神經元的修復，提高神經元存活率。腦缺血損傷發生早期，NGF會出現短時反應性表達，發揮神經元保護作用，但表達水平和時間有限，難以發揮全面持久的神經元保護作用。

對于腦缺血后神經損傷的保護而言，能持續增強NGF表達的治療方法，具有十分重要的意義。在細胞的分化、增殖和凋亡等生命周期活動中，PI3K/Akt信號通路可以發揮調節作用，該通路由許多靶點組成，其中蛋白激酶B(Akt)是最關鍵的一個，因為Akt磷酸化后處于活化狀態，通過激活可作用于下游的B細胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)家族等靶點，可降低下游Bax蛋白的表達，抑制凋亡，從而起到神經保護作用[13]。本研究結果表明，與假手術組比較，NGF表達顯著下降，PI3K/Akt通路受到抑制，Bcl-2蛋白表達顯著降低，Bax蛋白表達明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組和陰性對照組比較，hNGFβ組NGF表達顯著升高，PI3K/Akt通路得到激活，Bcl-2蛋白表達也顯著升高，Bax蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。轉染AAV6-hNGFβ-EGFP可提高NGF表達，激活大鼠PI3K/Akt通路，提高Bcl-2蛋白表達，抑制Bax蛋白增加，對大鼠腦缺血再灌注損傷起到保護作用。

在腦缺血再灌注動物模型中，提高NGF的表達，可激活PI3K/Akt通路的多個靶點，調控下游相關蛋白表達，發揮對腦缺血再灌注損傷的保護作用。Saito等[14]研究發現腦缺血損傷后，由于PI3K與NGF受到抑制，磷酸化PRAS(pPRAS)的表達出現下調，而加入NGF可以提高小鼠中pPRAS的表達，從而增強神經保護作用。遠端缺血后處理可以通過上調內皮型一氧化氮合酶(eNOS)，激活PI3K/Akt途徑而產生神經保護作用，減輕全腦缺血再灌注損傷[15]。此外，NGF還可通過激活PI3K/Akt途徑，減少內質網應激導致的心肌細胞凋亡，對心肌缺血再灌注損傷進行保護[16]。另一方面，NGF還可通過多種途徑保護神經元損傷，如抵消興奮性氨基酸毒性、調節神經元胞質內Ca2+水平和促進自由基的清除等。Rami等[17]研究發現，β2腎上腺素受體激動劑克倫特羅具有神經保護作用，其保護機制與上調NGF表達有關，NGF上調可增強鈣蛋白酶抑制蛋白的表達而產生神經保護效應。

Zhang等[18]研究發現，在腦卒中早期阻斷TRPV2表達后，可以通過MAPK/JNK途徑誘導NGF分泌，促進星形膠質細胞的增殖而產生神經保護作用。NGF的神經元保護作用還與轉錄因子AP-1的激活有關，Shashoua等[19]設計了一種NGF的模擬短肽，可以通過激活轉錄因子AP-1來進行腦卒中的治療。

綜上所述，本研究基于腦缺血再灌注大鼠模型，通過神經行為學、梗死體積、免疫組化和分子生物學等方法，發現轉染AAV6-hNGFβ可增強大鼠腦組織NGF表達，進而激活PI3K/Akt通路，提高Bcl-2蛋白表達，降低Bax蛋白合成，抑制凋亡，對大鼠腦缺血再灌注損傷起到保護作用，為腦卒中的臨床治療提供依據。