TMAO通過PI3K/AKT/mTOR信號通路影響心臟原代成纖維細胞的增殖

趙 雨 劉向東 呂家順 張慶勇

在人體攝入富含卵磷脂、膽堿、L-肉堿的高脂營養物質后，經某些特定的腸道微生物酶復合物的分解代謝，首先產生三甲胺(trimethylamine，TMA)。TMA進入門靜脈系統后，經肝臟含黃素單氧化酶(flavin-containing monooxygenases)氧化，即產生TMAO[1]。TMAO除了與慢性腎臟疾病、2型糖尿病及肥胖關系密切外，還參與心血管代謝性疾病，如心肌肥大、心臟纖維化。TMAO的產生、代謝過程與心血管疾病的發生高度相關，可作為心血管疾病治療的潛在靶點[2,3]。

心臟間充質細胞，也被簡稱為“成纖維細胞”，是心臟中分布最廣的細胞類型之一[4]。哺乳動物心臟的正常功能主要由心肌細胞和心臟成纖維細胞(CF)相互協調、相互作用來維持的，這兩種細胞占心臟細胞的90%[5]。在人類心臟中，心臟成纖維細胞占60%～70%，是細胞外基質的主要來源，除在細胞和非細胞組分間的機械、化學、電信號的轉導中發揮作用外，在高血壓、心肌梗死及心力衰竭發生時的心臟重構過程中也發揮重要作用[6]。腸道菌群代謝對人體的影響日益受到關注，但其代謝產物是如何影響人體病理生理進程的，是否會對心臟重構造成影響，尚缺乏足夠研究，本研究旨在探索TMAO影響心臟成纖維細胞增殖的可能作用機制。

材料與方法

1.材料: 小鼠原代心臟成纖維細胞購自上海拜力生物科技有限公司; 一抗抗體PI3K(phosphatidyl inositol 3-kinase,#4292)、p-PI3K(Tyr458,#4228)、AKT(protein kinase B,#9272)、p-AKT(Thr308,#13038)、mTOR(mammalian target of rapamycin, #2972)、p-mTOR(#2974)、GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,#5174)購自美國Cell Signaling Technology 公司; 二抗山羊抗兔購自北京博奧森公司;DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)、胎牛血清購自美國 Gibco 公 司; 氧化三甲胺(TMAO)、LY294002(PI3K抑制劑)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide， DMSO)購自美國 Sigma 公司; BCA 蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術公司; 增強型化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL) 顯影液購自美國Thermo公司; PowerPac Universal 電泳裝置購自美國 Bio-Rad 公司; EPOCH 型酶標儀購自美國BioTek公司。

2.方法: (1) 細胞培養:在5% CO2、37℃的培養條件下培養原代心臟成纖維細胞。培養液為含10%胎牛血清的DMEM。待細胞長滿后使用PBS 2毫升/次沖洗 2次，然后加入 2ml 0.25%的胰酶消化1min，再加入2ml培養液終止消化。使用槍頭將貼壁細胞吹打下來，將細胞懸液吸入15ml離心管以 0.9×g速度離心3min，離心后棄去上清，將細胞混勻后按以5×105細胞密度接種于6孔板中。(2) 細胞處理: 濃度梯度組：分別用含0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0μmol/L TMAO的培養基培養原代心臟成纖維細胞，48h后收集細胞；時間梯度組：分別用TMAO處理原代心臟成纖維細胞0、15、30、60min；抑制劑組：在用TMAO處理細胞前，加入PI3K抑制劑LY294002 10μmol/L預處理細胞30min。(3)Western blot法檢測蛋白表達: 處理結束后，每孔加入100μl 含1%苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)和10%磷酸酶抑制劑的細胞裂解液裂解細胞。待細胞充分裂解后離心，取上清后使用BCA檢測試劑盒進行蛋白定量，濃度調齊后煮沸15min。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 跑完后用二氟乙烯(polyvinylidene floride，PVDF)膜進行轉膜。然后40ml TBST中加入2g牛奶混勻后于室溫下將膜封閉2h， 一抗PI3K、p- PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、GAPDH 4℃ 孵育過夜。TBST 10分鐘/次將膜洗滌3次。室溫下孵育二抗 2h，TBST 10分鐘/次將膜洗滌 3 次。使用 Image Quant LAS 4000 mini 進行顯影。

結 果

1.在用不同濃度的TMAO處理心臟成纖維細胞后，各蛋白表達量的變化：Western blot法檢測結果表明，隨著TMAO濃度不斷提高，p- PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達量呈增加趨勢，其中p- PI3K 在TMAO為10μmol/L 的時候表達量最高，p-AKT和p-mTOR在TMAO為25μmol/L 的時候表達量最高。

2.用濃度為10 μmol/L的TMAO，分別處理心臟成纖維細胞0、15、30、60min后，各蛋白表達量的變化：隨著培養時間延長，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達量呈增加趨勢，其中p- PI3K 在培養30min的時候表達量最高，p-AKT和p-mTOR在培養60min的時候表達量最高。

3.PI3K/AKT/mTOR信號通路各蛋白表達量的變化：用PI3K抑制劑LY294002預處理細胞30min后，再用10μmol/L 的TMAO處理細胞后，與單純用TMAO處理的細胞比較，同時用PI3K抑制劑處理組，其p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達量明顯減少。

討 論

一直以來，飲食都被認為與心血管疾病的發生有關，而近幾年的研究也表明，營養攝入、腸道菌群代謝參與宿主心血管疾病的發生、發展。此外，宿主體內微生物產生的多種代謝物，如氧化三甲胺、短鏈脂肪酸(short chain fat acids,SCFAs)和次級膽汁酸(secondary bile acids)，也會參與心血管疾病的病理生理過程。盡管一些強效降脂藥已廣泛應用于臨床，心血管疾病位居是發達國家人口死亡原因之首，因此進一步明確心血管疾病治療的靶點勢在必行[7]。近10年來的研究發現，氧化三甲胺(TMAO)、短鏈脂肪肪酸(SCFAs)和次級膽汁酸在心血管疾病的發展中發揮特定作用，盡管一些大型抗生素治療試驗未能發現可以讓心血管疾病患者獲益，但目前心血管藥物研究儼然已進入以腸道菌群代謝產物為靶點的新領域[8,9]。有研究發現，TMAO可以通過TGF-β/SMAD3信號通路促進心臟和腎臟的纖維化[10]。

圖1 TMAO不同濃度處理后，信號通路各蛋白表達量的變化A.Western blot法檢測不同濃度的TMAO處理心臟成纖維細胞后各磷酸化蛋白表達的變化；B.p- PI3K/PI3K；C.p-AKT/AKT；D.p-mTOR/mTOR

圖2 TMAO不同時間處理后，信號通路各蛋白表達量的變化A.Western blot法檢測用濃度為10μmol/L的TMAO處理心臟成纖維細胞不同時間后各磷酸化蛋白表達量的變化;B.p-PI3K/PI3K;C.p-AKT/AKT;D.p-mTOR/mTOR

圖3 PI3K抑制劑LY294002預處理后，信號通路各蛋白表達量的變化A.Western blot法檢測經PI3K抑制劑LY294002預處理心臟成纖維細胞后各磷酸化蛋白表達的變化；B.p-PI3K/PI3K;C.p-AKT/AKT;D.p-mTOR/mTOR。與抑制劑預處理組比較，*P<0.05

在健康的心臟中，成纖維細胞是參與心臟結締組織形成和維持的主要細胞類型。心臟結締組織包含細胞和非細胞成分，其中的細胞外基質(extracellular matrix,ECM)可以為心肌細胞提供穩定的結構，使心臟成為一個整體[6]。而纖維化是許多常見心血管疾病諸如心肌梗死和高血壓的自然后遺癥，并且通常加劇心血管疾病和心力衰竭的進展，此外，心臟局部瘢痕和散在纖維化也是擾亂正常電生理活動、導致心律失常發生的獨立因素，但目前還沒有專門針對纖維化的治療方法[11]。因此，控制心臟成纖維細胞和肌成纖維細胞增殖、表型轉化和基質合成這些行為的調節過程和細胞內信號轉導途徑代表了抗纖維化治療發展的研究重點[12]。PI3K/AKT/mTOR信號通路可通過多種潛在機制影響細胞生長、細胞增殖、細胞存活及糖吸收[13]：PI3K通過產生三磷酸磷脂酰肌醇引起信號級聯放大反應，并激活AKT；AKT可以對胞內胞外多種刺激作出反應，是細胞存活重要的調節器；mTOR作為一種相對分子質量為289000的非典型絲蘇氨酸蛋白激酶，可調節細胞生長，主要受PI3K/AKT/mTOR信號通路的調控[14]。

本研究發現，TMAO增加了PI3K/AKT/mTOR細胞增殖信號通路中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達量，說明TMAO可能通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路影響心臟成纖維細胞的增殖。為了進一步驗證，筆者使用了PI3K抑制劑LY294002將PI3K的活性抑制后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達量均明顯降低，即使加入TMAO處理，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達量也未發生明顯升高，進一步表明了TMAO可以通過PI3K/AKT/mTOR信號通路發揮作用。

綜上所述，本研究發現TMAO可以激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，并可能通過該信號通路促進心臟成纖維細胞的增殖，這有助于進一步了解TMAO促進心臟纖維化的分子機制，而TMAO促纖維化是否還有其他分子機制參與，尚需進一步探究。