組蛋白去乙酰化酶抑制劑阻斷ERK/MAPK信號通路抗急性T淋巴細胞白血病的機制研究

高 曉 沈莉菁 劉嘉穎 李 香

急性T淋巴細胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)好發于青少年，以常伴縱膈巨塊，胸腔積液，易浸潤中樞神經系統、肝臟、脾臟等組織，進展兇險，常規化療不敏感著稱。其發病機制涉及多種基因突變、信號通路轉導和表觀遺傳因子改變[1]。近年來，隨著化療、免疫治療及造血干細胞移植等綜合治療手段的發展，T-ALL患者的整體生存率有所改善，但仍有相當部分患者為復發難治[2,3]。因此，迫切需要尋找更有效的治療靶點。

近年來研究發現，腫瘤細胞組蛋白乙酰化水平高的T-ALL患者，提示預后較好[4]。但多數患者存在組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)的異常高表達，導致組蛋白乙酰化水平較低，因此，筆者推測HDAC可能是T-ALL的潛在治療靶點[5]。本研究旨在通過公共數據庫挖掘與分析T-ALL中HDAC各亞型的表達情況，針對異常高表達HDAC亞型，選用選擇性HDAC抑制劑西達本胺進行體外實驗，探討西達本胺對T-ALL細胞株的作用及可能的分子機制，為HDAC抑制劑在T-ALL的臨床應用，提供理論依據。

材料與方法

1.材料：人急性T淋巴細胞白血病細胞株A3和Molt-4(上海中國科學院細胞庫)。西達本胺由深圳微芯生物科技股份有限公司惠贈；二甲基亞砜(DMSO)購自美國MP Biomedicals公司；RPMI 1640培養基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素混合液購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒為日本同仁化學研究所產品；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒為凱基生物公司產品；蛋白酶抑制劑、細胞裂解液NP-40、Pierce ECL蛋白發光底物試劑盒為美國Thermo Scientific公司產品，兔抗GAPDH、乙酰化H3K9(acetylated H3K9，Ac H3K9)、Mcl-1、BAX、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)、剪切型PARP(cleaved PARP)、細胞外信號調節激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(phosphorylated ERK1/2, p-ERK1/2)單克隆抗體，鼠抗Bcl-2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9 (cysteinylasparate specific proteinase 9, caspase-9)單克隆抗體，山羊抗兔、山羊抗鼠HRP標記二抗均為美國Cell Signaling Technology公司產品；西達本胺溶于DMSO配制成10mmol/L儲存液，-20℃保存，使用前用培養基稀釋至工作濃度，使DMSO終濃度<1%。

2.方法:(1)數據庫挖掘和分析：Oncomine數據庫(https://www.oncomine.org)中分別檢索HDAC1-11亞型在急性白血病與正常對照組中的表達情況，并進行統計學分析。(2)細胞培養：A3和Molt-4細胞均使用同一批次含10%胎牛血清、1% 100U/L青霉素、1% 100mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養液，置于37℃、5%CO2且飽和濕度的細胞培養箱中，每隔1～2天更換培養液1次，倒置相差顯微鏡下觀察，維持密度在(2～10)×105/ml。取對數生長期細胞用于實驗。(3)CCK-8檢測A3和Molt-4細胞增殖活力：取對數生長期的A3和Molt-4細胞株，按1×104個/孔細胞接種于96孔板中，設置空白組、對照組及實驗組(西達本胺以100μmol/L為起始濃度，3倍梯度稀釋，使終濃度分別為0.045、0.130、0.410、1.200、3.700、11.000、33.000、100.000μmol/L)，每孔總體積為100μl，每組設5個復孔，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱內分別孵育24、48、72h后，每孔避光加入10μl CCK-8溶液，將培養板放回培養箱中繼續孵育2.5h后，用酶標儀測定在450nm處的吸光度(A)值。細胞存活率(%)=[(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%。應用Graphpad Prism 7.0軟件計算藥物的IC50。(4)流式細胞術檢測A3和Molt-4細胞凋亡:取對數生長期的A3和Molt-4細胞株于6孔板，每孔接種細胞3×105個，實驗組加入西達本胺使其終濃度分別為0.5、1.0、2.0μmol/L，同時設置對照組，37℃、5% CO2條件下培養48h。離心收集細胞，PBS洗滌2次，各組加入150μl Binding buffer重懸細胞后，實驗組依次加入Annexin V-FITC和PI各5μl(Annexin V-FITC單染管只加入5μl Annexin V-FITC，PI單染管只加入5μl PI)混勻后室溫避光孵育15min，最后各組再加入350μl Binding buffer輕輕混勻，1h內上機檢測。(5)免疫蛋白印跡(Western blot)法檢測組蛋白H3K9乙酰化、凋亡及ERK/MAPK信號通路蛋白水平：實驗組西達本胺(終濃度為0.5、1.0、2.0μmol/L)分別處理A3和Molt-4 48h，同時設置對照組，PBS洗滌2次后收集細胞，加入含1%蛋白酶抑制劑cocktail的NP-40細胞裂解液提取總蛋白，冰上裂解30min后超聲3次，5秒/次，收集總蛋白上清，用BCA法進行蛋白定量，加樣至4%～10%的梯度SDS-PAGE凝膠中，經電泳、濕轉至NC膜、5% BSA封閉、一抗4℃孵育過夜、TBST洗膜3次、二抗孵育、TBST洗膜3次后，ECL顯影成像。使用Image J軟件對各條帶進行灰度分析，并以目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

結 果

1.HDAC1～11各亞型在T-ALL患者骨髓標本中的表達情況：本研究通過對Oncomine數據庫(https://www.oncomine.org)進行深入挖掘，分析比較急性髓性白血病、急性B淋巴細胞白血病、T-ALL患者相對于正常對照組中HDAC1～11各亞型的表達情況。Ⅰ類HDAC1、2、3和Ⅱ類HDAC9、10在T-ALL組表達水平較正常對照組顯著升高(HDAC1:t=8.398，P=2.38×10-7；HDAC2:t=6.976，P=2.41×10-6；HDAC3:t=3.359，P=0.002；HDAC9:t=6.814，P=5.55×10-6；HDAC10:t=9.493，P=6.72×10-8)；HDAC5、6、8、11表達水平在T-ALL中與正常對照組比較，差異無統計學意義。

2.西達本胺對T-ALL細胞株增殖的影響：本研究使用選擇性HDAC抑制劑西達本胺(靶點為HDAC1、2、3、10)和T-ALL細胞株A3、Molt-4進行后續實驗。西達本胺(終濃度為0.045、0.130、0.410、1.200、3.700、11.000、33.000、100.000μmol/L)分別處理A3和Molt-4細胞株24、48、72h后，兩種細胞存活率均隨藥物濃度和處理時間的增加而明顯降低(P<0.05，圖1)，呈時間-濃度依賴性。西達本胺作用A3和Molt-4細胞株24h后的IC50值分別為2.24±0.18μmol/L和1.68±0.32μmol/L，48h的IC50值分別為0.66±0.10μmol/L和0.61±0.04μmol/L，72h的IC50值分別為0.29±0.13μmol/L和0.43±0.20μmol/L。

圖1 CCK-8檢測不同濃度西達本胺處理后A3和Molt-4細胞增殖曲線A.A3;B.Molt-4;與0μmol/L比較，*P<0.05，**P<0.01 (n=3)

3.西達本胺對T-ALL細胞株組蛋白H3K9的乙酰化水平的影響：本研究使用0.5、1.0、2.0μmol/L西達本胺分別處理A3和Molt-4細胞48h，組蛋白H3K9的乙酰化水平均較基線明顯升高，呈濃度依賴(P<0.05，圖2)。

圖2 Western blot法檢測不同濃度西達本胺對A3和Molt-4細胞組蛋白H3K9乙酰化水平的影響Ac H3.乙酰化的組蛋白H3K9；H3.內參蛋白；與0μmol/L比較，*P<0.01(n=3)

4.西達本胺對T-ALL細胞株凋亡的影響：0.5、1.0、2.0μmol/L西達本胺分別作用于細胞株A3和Molt-4 48h后，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率。西達本胺誘導A3細胞凋亡的比率隨濃度增加而遞增(圖3A)，分別為14.60%±0.89%、17.11%±1.96%、26.51%±1.18%，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。Molt-4細胞獲得了類似結果(圖3B)，分別為4.74%±1.20%、5.76%±1.36%、10.48%±0.91%，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 流式細胞術檢測不同濃度西達本胺對A3和Molt-4細胞凋亡的影響A.A3;B.Molt-4;與0μmol/L比較，*P<0.05，**P<0.01(n=3)

5.西達本胺誘導T-ALL細胞株凋亡的可能機制：0.5、1.0、2.0μmol/L西達本胺分別作用于細胞株A3和Molt-4 48h后，Western blot法檢測結果顯示，與對照組比較，抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1均顯著下調(P均<0.05)，促凋亡蛋白BAX、線粒體凋亡途徑蛋白活化型caspase-9、剪切型PRAP均顯著上調(P均<0.05，圖4)。Western blot法檢測與細胞凋亡相關的ERK/MAPK信號通路蛋白，與對照組比較，p-ERK1/2蛋白水平均明顯降低(P均<0.05)，且0.5μmol/L的西達本胺即可明顯下調A3細胞株的p-ERK1/2蛋白水平(P<0.05,圖5)。

圖4 Western bolt法檢測不同濃度西達本胺對A3和Molt-4細胞相關凋亡蛋白表達的影響A.A3;B.Molt-4;Cleaved caspase-9.半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9；Cleaved PARP.剪切型多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶；以各凋亡蛋白與內參蛋白GAPDH灰度值的比值作為蛋白相對表達水平；A:A3;B.Molt-4;與0μmol/L比較，*P<0.01(n=3)

圖5 Western bolt法檢測不同濃度西達本胺對A3和Molt-4細胞中ERK1/2通路蛋白表達的影響A.A3;B.Molt-4;ERK1/2 細胞外信號調節激酶1/2；p-ERK1/2 磷酸化ERK1/2；以各通路蛋白與內參蛋白GAPDH灰度值的比值作為蛋白相對表達水平；與0μmol/L比較，*P<0.05，**P<0.01(n=3)

討 論

組蛋白乙酰化在染色體重塑和調節轉錄活性方面發揮重要作用，主要受HDAC和組蛋白乙酰化轉移酶的共同調節。其中，HDAC可降低組蛋白的乙酰化水平，使染色質結構變得致密從而抑制基因轉錄，促進腫瘤的發生。

HDAC異常高表達與T-ALL的發生有著密切的關系。文獻報道，急性白血病患者中組蛋白低乙酰化并與不良預后相關[5]；Gruhn等研究發現，與正常骨髓和外周血比較，ALL患者中Ⅰ類HDAC1、2、8高表達，這解釋了之前研究中組蛋白低乙酰化的結果；此外，Moreno等發現HDAC1和2高表達與T細胞表型相關；Cardoso等[6]發現T-ALL患者可經染色體易位使轉錄因子TAL1過表達，進而招募含HDAC1的復合物促進T-ALL的發生。以上研究結果均提示Ⅰ類HDAC在T細胞白血病的發生中扮演著重要角色，也為T-ALL的治療提供了新思路。本研究通過數據庫挖掘分析發現Ⅰ類HDAC1、2、3和Ⅱ類HDAC9、10在T-ALL中顯著高表達，結果與文獻報道基本一致。

HDAC抑制劑具有廣泛的抗腫瘤能力和較低的毒副作用，因此，臨床上常作為多種血液腫瘤及實體瘤常規放、化療手段的補充[7～9]。我國自主研發的新型HDAC抑制劑西達本胺主要針對ClassⅠ類的HDAC1、2、3以及Class Ⅱ類的HDAC10，目前的臨床適應癥為復發難治性外周T細胞淋巴瘤。其作用機制和療效，與腫瘤類型密切相關[10,11]，總體上可通過增加組蛋白H3和H4，以及非組蛋白p21、p53、C-MYC等乙酰化水平，調控相應基因轉錄，誘導細胞周期阻滯、促進腫瘤的分化、誘導細胞凋亡等發揮抗腫瘤作用，但在T-ALL中具體作用及機制研究較少。

本研究中西達本胺不僅對細胞株A3和Molt-4的增殖有明顯的抑制作用，而且在不同時間點的IC50接近，抑制作用均呈濃度、時間依賴性的方式。隨著西達本胺濃度的增加，T-ALL細胞株中組蛋白H3K9乙酰化水平明顯增加，提示在表觀遺傳方面，西達本胺可有效抑制HDACs，增加組蛋白乙酰化水平。除抑制白血病細胞株增殖外，本研究選取西達本胺48h IC50左右的濃度進行細胞凋亡率的檢測，發現西達本胺可顯著誘導A3和Molt-4細胞的凋亡，且隨濃度而遞增。

在凋亡信號傳遞過程中，Bcl-2家族中抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白共同影響線粒體膜的通透性，調控細胞色素C等細胞因子釋放，激活caspase-9，再激活下游caspase效應分子,切割多種蛋白分子，如DNA損傷修復蛋白PARP，執行細胞凋亡的生物功能[12]。本研究發現，西達本胺可明顯下調細胞株A3和Molt-4中抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1，上調促凋亡蛋白BAX、活化型caspase-9和剪切型PARP蛋白表達，這表明西達本胺可經線粒體途徑介導T-ALL細胞凋亡。

腫瘤細胞的生長受到多種細胞外信號調控，調控細胞增殖及凋亡的經典信號通路促分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK)，受特定蛋白(ERK1/2、JNK、p38)的磷酸化活化形式介導，是多種腫瘤發病和轉移的分子基礎。在T-ALL中，ERK1/2/MAPK信號通路的異常激活是主要發病機制之一，而JNK/MAPK或p38/MAPK信號通路在T-ALL中無明顯異常改變[13]。T-ALL患者很少發生ERK突變，但大約35%的成人T-ALL患者存在ERK1/2的持續激活，且與高白細胞數、對類固醇類藥物反應差等不良預后因素有關[14]。ERK1/2的過度活化可影響腫瘤細胞的凋亡信號傳遞，主要通過間接影響細胞增殖通路NF-κB以及直接調控凋亡蛋白和caspase依賴的凋亡途徑抑制細胞凋亡的發生[15,16]。因此，ERK1/2信號通路受抑可促進細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用[17]。本研究發現，西達本胺可明顯下調細胞株A3和Molt-4中p-ERK1/2蛋白的表達，因此，筆者推測西達本胺誘導T-ALL細胞凋亡的作用，可能與抑制ERK1/2信號通路的活化有關。

綜上所述，針對T-ALL中高表達的Ⅰ類和Ⅱ類HDACs，本研究通過體外細胞實驗表明西達本胺能有效抑制T-ALL細胞株A3和Molt-4細胞的增殖，增加組蛋白H3K9乙酰化水平，并通過調控凋亡蛋白表達和激活線粒體途徑誘導細胞凋亡，其抗腫瘤機制可能與抑制ERK/MAPK信號通路轉導有關，這為選擇性HDAC抑制劑用于治療T-ALL提供了部分理論和實驗依據。