HPLC法同時測定紅花如意丸中3種有效成分

韓小月 王俊芳 李菲 曹秋娥

（1.云南華測檢測認證有限公司 云南昆明 650000；2.云南大學 化學科學與工程學院）

1 前言

紅花如意丸作為傳統藏藥，由紅花、西紅花、鬼臼（桃兒七）、訶子、藏茜草等20 多味藥材組成，具有活血化瘀、祛風鎮痛等功能，可用于治療慢性盆腔疼痛、下肢關節疼痛、筋骨腫脹、麻木、小腹冷痛及寒濕性痹癥等[1-3]。羥基紅花黃色素A（HSYA）是檢驗紅花品質的指標性成分[4]，具有擴張冠狀動脈、保護心肌、降血壓、抗氧化、免疫抑制等多種功能[5]；西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ則是西紅花質量控制的指標性成分，具有抗血小板聚集、保護血管、改善心肌缺血和調血脂等功效。因此，分析測定紅花如意丸中的羥基紅花黃色素A、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ具有重要意義。目前，已有不少文獻對一些藥材或制劑中的羥基紅花黃色素A 或西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的分析檢測進行了研究，但對這3 種成分的同時分析檢測很少。本文采用高效液相色譜（HPLC）法，研究了紅花如意丸中羥基紅花黃色素A、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ這3 種成分的同時分析檢測，該法簡單、快速、準確，對紅花如意丸的質量控制有一定的參考價值。

2 儀器與材料

Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；Agilent eclipse XDB-C18 色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm（美國安捷倫科技公司）；優普特實驗室超純水器（UPT-Ⅰ-20T，成都超純科技有限公司）；SG7200HE 超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）。對照品羥基紅花黃色素A、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ（中國藥品生物制品鑒定所），規格均為98%；HPLC 分析用流動相甲醇為色譜純（美國Fisher 公司）；磷酸及其他實驗用品甲醇均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；紅花如意丸（甘南佛閣藏藥有限公司）。

3 方法與結果

3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent eclipse XDB-C18（4.6mm×250mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.3%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，45%～100%A）；流速：1.0 mL／min；柱溫：30℃；檢測波長：403 nm；進樣量：5 μL。

3.2 對照品溶液的配制

對照品羥基紅花黃色素A（0.60 mg/mL）、西紅花苷Ⅰ（0.94 mg/mL）和西紅花苷Ⅱ（0.88 mg/mL）的單標儲備液由甲醇配制，4℃冰箱儲存。對照品羥基紅花黃色素A（120 μg/mL）、西紅花苷Ⅰ（188 μg/mL）和西紅花苷Ⅱ（176 μg/mL）的混合溶液由各對照品的單標儲備液用甲醇配合。

3.3 供試品溶液的配制

取20 粒紅花如意丸，研至細粉，精密稱取粉末約0.25 g，置棕色瓶中，加入25 mL 甲醇，超聲處理1 h，過濾，減壓蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至10 mL，使用前用0.45 μm 微孔濾膜濾過。

3.4 方法學考察

3.4.1 線性關系考察

配制不同濃度的混合對照品溶液，精密吸取混合對照品溶液5 μL，在“3.1”項色譜條件下分別進行測定。以各組分濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，擬合回歸方程，結果詳見表1。

3.4.2 精密度考察

精密吸取同一濃度下的混合對照品溶液5 μL，在“3.1”項色譜條件下連續進樣5 次，測定羥基紅花黃色素A、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的峰面積，計算得到各組分峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為1.08%、1.52%和0.89%，表明儀器的精密度良好。

表1 各組分的工作曲線

3.4.3 重復性考察

分別精密稱取紅花如意丸粉末5 份，每份約0.25 g，按“3.3”項下方法制備成供試品溶液，依次進樣5 μL，測定羥基紅花黃色素A、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含量，計算得到各組分含量的相對標準偏差（RSD）分別為0.16%、0.74%和1.45%，表明方法的重復性良好。

3.4.4 加標回收率實驗

精密稱取3 份已知含量的紅花如意丸，每份約0.25 g，然后按羥基紅花黃色素A、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ在樣品中的含量的150%、100%和50%加入這3 種組分的標準品溶液，再按“3.3”項下方法制備供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件進行分析，計算加標回收率。結果表明，羥基紅花黃色素A、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的平均加標回收率依次為100%、98.9%和103.6%，相對標準偏差依次為1.43%、0.14%和0.79%。

3.5 樣品測定

準確稱取紅花如意丸3 份，按“3.3”項下方法制備供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件進行分析，然后用標準加入法對色譜圖中的組分進行定性識別，用外標工作曲線法對各組分進行定量分析，計算得到羥基紅花黃色素A、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ成分的含量分別為326.22 μg/g、682.13 μg/g 和97.87 μg/g。

3.6 色譜條件的優化

實驗首先嘗試了以甲醇-水、乙腈-水為流動相進行等度洗脫，結果發現，不管怎樣改變甲醇-水或乙腈-水的組成比，3 組分的分離情況和峰型都不夠理想。因此，實驗又進一步嘗試了以甲醇-水、甲醇-不同濃度（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）的磷酸水溶液和甲醇-不同濃度（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）的醋酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，結果發現，以甲醇（A）-0.3%磷酸水溶液（B）進行梯度洗脫（0～20 min，45%～100%A）效果最好。實驗還對比了柱溫為30℃和40℃時的分離情況，最終選擇了效果更佳的30℃為柱溫。在選定的色譜條件下，混合對照品溶液和紅花如意丸樣品溶液的色譜圖詳見圖1。

圖1 混合對照溶液液相色譜圖（a）和紅花如意丸樣品液相色譜圖（b）

由圖1 可知，羥基紅花黃色素A、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ不僅彼此之間在9 min 內得到了有效分離，而且還與樣品紅花如意丸中的其他共存組分之間得到了有效分離。

4 結語

本實驗建立了一個可以同時分離測定紅花如意丸藥品中的羥基紅花黃色素A、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的高效液相色譜新方法。結果表明，在本實驗選定條件下，羥基紅花黃色素A、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ這3 種成分在9 min 內實現了基線分離與有效檢測。測試樣品中，各目標成分的加標回收率為98.9%～103.6%，相對標準偏差小于1.5%，說明該方法具有簡單、快速、準確度高和重現性好的優勢。