利用添加擴增內標的重組酶聚合酶法檢測霍亂弧菌

莊濠宇 李偉 李窕妍 張崢嶸 溫爾英 陳冬娥 周廣彪*

（1.揭陽海關 廣東揭陽 522000；2.梅州海關；3.揭陽市市場監督管理局；4.汕頭海關）

1 前言

霍亂弧菌（Vibrio Cholerae）引起的急性腸道傳染病為我國甲類傳染病[1，2]，其發病急、傳播快、范圍廣，如不及時搶救，病死率高[3]。傳統的微生物學檢測方法一般歷時4 d 以上，并且需要血清群鑒定才能做最終分類判定[4，5]，耗時長、步驟煩瑣、人員操作誤差大。聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）可以在保持較高靈敏度[6]的前提下縮短檢測周期，而聚合酶重組酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技術能夠在25～43℃恒溫的條件下[7，8]，10 min內檢出擴增產物[9]，從而大大提升檢測效率。然而，食品樣品尤其是水產品中往往含有較多的抑制劑[10]，會導致PCR 出現假陰性，這也是PCR 方法未能成為大多數國家食品檢測的法定方法和最終判定依據的原因之一。引入擴增內標（Internal Amplification Control，IAC）在待測樣品中添加看家基因，與目標基因同步擴增，進而指示PCR 反應假陰性出現與否，最終提高檢測準確性。

PRA 技術與擴增內標技術結合應用于水產品致病菌檢測的研究并不多見，本文利用RPA 技術檢測霍亂弧菌并添加擴增內標，可在保證靈敏度和特異性的前提下，達到更穩定、更可靠的應用檢測效果。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

霍亂弧菌（ATCC39315）、溶藻弧菌（ATCC17749）、創傷弧菌（ATCC27562）、副溶血弧菌（ATCC17802）、河流弧菌（ATCC33809）、擬態弧菌（ATCC33653）、哈維氏弧菌（ATCC33842）、大腸埃希菌（ATCC25922）、沙門氏菌（ATCC14028）、單增李斯特菌（ATCC19114）和金黃色葡萄球菌（ATCC25923）的標準菌株（廣東食品微生物安全工程技術研究開發中心、中國科學院水生生物研究所、美國MBL 公司）；實驗樣品為選取的本機構檢測樣品；……