以浸米水為原料生產細菌纖維素

曹 艷，夏其樂，*，陳劍兵，單之初

(1.浙江省農業科學院 食品科學研究所，農業農村部果品采后處理重點實驗室，浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室，浙江 杭州 310021； 2.浙江塔牌紹興酒有限公司，浙江 紹興 312000)

細菌纖維素(BC)是由木醋桿菌產生的一類胞外大分子多糖，與植物纖維一樣，由葡萄糖分子以β-1，4-糖苷鍵聚合而成[1]。但是，BC具有植物纖維無法比擬的優點，如吸水性強、純度高、結晶度高，以及生物適應性強、機械強度高等[2-3]。BC作為食品配料(稱為椰果或納塔)，可改善食品的口感和品質，在國際市場上暢銷不衰[2，4]。此外，BC還可用作造紙、化妝品、聲學器材、醫藥等領域的新型材料[2，5]。因此，BC的需求量逐年增加。目前，規模化生產BC的主要原料為自然發酵椰子水(以下簡稱椰子水)，產率為10～14 g·L-1[6]，國內僅海南少量生產BC，大部分從越南等東南亞國家進口。

已有研究報道表明，水果汁，以及富含糖和氮的農副產品加工副產物均可作為生產BC的原料[7-9]。浸米水是黃酒釀造過程的主要副產物之一，稻米中的淀粉、蛋白質、維生素等物質在浸米過程中溶出，大量乳酸菌和酵母菌在其中生長代謝，產生糖類、氨基酸和有機酸等營養物質[10]。目前，浸米水主要經過沉降和曝氣處理后排放[11-12]，處理成本較高，但若不經處理直接排放，則會造成嚴重的環境污染。楊一沖等[13]的研究表明，椰子水pH值在2.0～3.0，其中，以乳酸、乙酸和乙醇最多。浸米水與椰子水外觀看起來相似，也含有乳酸等有機酸，但直接以浸米水為原料發酵BC產量非常低，這可能是由于其中的某些關鍵組分在含量上有較大差別。本研究對比了浸米水與椰子水中糖類、蛋白質、乳酸、乙酸和乙醇含量的差異，并分析其與BC產量的相關性，確定影響浸米水發酵生產BC的主要因素，優化以浸米水為原料的發酵培養基組分，研究所得BC的常規性質和化學組成，為擴大BC生產原料范圍和高效利用浸米水提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

木醋桿菌Gluconacetobacterxylinus，購于微生物菌種保藏中心，保存于-80 ℃冰箱。浸米水，取自浙江塔牌紹興酒有限公司，經沉降、200目(75 μm)濾布過濾后，濾液用于配制BC發酵培養基。葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、Na2HPO4、(NH4)2SO4、MgSO4等均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨、酵母浸提物，購自OXIOID。

1.2 儀器與設備

UV-1800型紫外可見分光光度計，日本島津公司；WYA-Z自動阿貝折射儀，上海儀電科學儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，北京發恩科貿有限公司；生化培養箱，上海博訊實業有限公司；超低溫冰箱，三洋電機國際貿易有限公司；Agilent1200高效液相色譜，美國安捷倫公司；Agilent7890氣相色譜，美國安捷倫公司；TA.XT Plus型質構儀，英國Stable Micro Systems；NTS傅里葉變換紅外光譜儀，美國Perkin-Elmer有限公司；D/Max-2550pc型X-射線衍射儀，日本Rigagu公司；H-7650掃描電鏡，HITACHI公司。

1.3 培養基和培養條件

種子培養基，參考HS培養基[14]，各組分(g·L-1)如下：蔗糖20，酵母浸提物3，蛋白胨3，Na2HPO4·12H2O 2.7，檸檬酸1.15，用蒸餾水補足至1.0 L。自然pH，115 ℃滅菌15 min。接種后于30 ℃靜置培養3～4 d。

以浸米水為原料的發酵培養基，參照HS培養基[14]，在浸米水中添加不同碳源、氮源，于300 mL燒杯中裝120 mL培養基，115 ℃滅菌15 min。接種量(體積分數)3.0%～5.0%，30 ℃靜置培養7～10 d。根據BC產量確定最適碳源和氮源及其最適添加量。

1.4 測定方法

1.4.1 BC產量

發酵結束后，取出BC，用水沖洗幾次除去表面培養基和雜質，再將BC浸泡于0.1 mol·L-1的NaOH溶液中，80 ℃水浴加熱20 min，然后用蒸餾水多次浸泡沖洗，直至用pH試紙輕壓膜測pH值為中性，去除BC膜中的菌體和殘留培養基。105 ℃干燥至質量恒定，BC產率用單位體積培養基中的BC干質量表示(g·L-1)。

1.4.2 培養基理化指標

可溶性固形物含量[白利度(Birx),%]用WYA-Z自動阿貝折射儀測定[15]，總蛋白含量采用考馬斯亮藍染色法測定[16]。葡萄糖、蔗糖、果糖含量采用高效液相色譜檢測，檢測條件：Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm， 9 μm)，0.005 mol·L-1H2SO4溶液，流速0.6 mL·min-1，柱溫40 ℃，進樣量10 μL，示差折光檢測器。乳酸采用高效液相色譜檢測，檢測條件：C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，流動相A為甲醇，流動相B為磷酸二氫鉀水溶液(0.02 mol·L-1，pH值2.4)；梯度洗脫：0 min，95%(體積分數，下同)B，5% A；25 min，15% B，85% A；35 min，95% B，5%A；45 min，95% B，5% A；流速 1.0 mL·min-1，紫外檢測波長210 nm。乙酸和乙醇采用氣相色譜檢測，檢測條件：毛細管柱色譜柱(30 m×0.32 mm)；程序升溫：初始柱溫45 ℃，保留時間2 min，升溫速率3 ℃·min-1，終止溫度150 ℃，保留時間10 min；氣化室溫度220 ℃，載氣為高純氮氣，載氣流速1 mL·min-1；火焰離子化檢測儀(FID)檢測器，檢測器溫度220 ℃，H2流速30 mL·min-1，分流比50∶1。

1.4.3 BC含水量和持水力

將清洗過的BC切成3 cm×3 cm的方塊，在去離子水中浸泡2 h，稱其質量，然后將BC用3層濾紙包裹，放入離心管中，6 000 r·min-1離心20 min，將離心后的BC于105 ℃烘干，再次稱其質量。分別計算含水量和持水力[7]。

1.4.4 BC硬度

將清洗過的BC切成3 cm×3 cm的方塊，采用質構儀測定BC硬度，用探頭(P/0.5型)下降過程中的最大壓力(N)表征。

2）開展節能監測和能源審計，提升管理水平。中國海油每年以文件形式下發《節能減排監督監測和能源審計計劃》，組織對有關企業進行審計、監測和節能診斷，幫助企業挖掘節能潛力提高節能管理能力。

1.4.5 BC微結構

將清洗、干燥后的直徑0.5 cm圓片狀BC固定于樣品臺上，經過噴金處理后，利用掃描電鏡觀察BC微結構。

1.4.6 紅外光譜掃描

將干燥后的BC磨成粉，過80目(178 μm)篩。將過篩后的BC粉與干燥KBr(質量比約為80∶1)在瑪瑙研缽中混合均勻研細，用壓片器(壓力項設置為2.0 kg)壓成透明薄片，然后將薄片放入傅里葉紅外光譜儀中進行測定(量程為400～4 000 cm-1)。

1.4.7 X-射線衍射光譜分析

將干燥后的BC磨成粉，過100目(150 μm)篩后進行X-射線衍射分析。測試條件：Cu靶，Kα射線，λ=1.54 ?，X光管電壓為40 kV，電流為40 mA，掃描范圍2θ=8.0°～40.0°，掃描步長為0.033°。用MDI Jade 9.0擬合峰面積，計算結晶度指數(CrI)[8]。

1.5 數據處理與分析

所有試驗數據均重復測定3次，取平均值。采用Excel 2010對數據進行整理。利用IBM SPSS 21.0對數據進行偏相關性分析，并計算偏相關系數r：|r|≥0.8表示顯著相關，0.5≤|r|<0.8表示相關性較高，|r|≤0.5表示相關性低。

2 結果與分析

2.1 浸米水與椰子水的理化指標比較

如表1所示，浸米水和椰子水的pH值，以及乳酸和乙醇含量相差不大，但浸米水中乙酸、可溶性固形物、葡萄糖和總蛋白含量均顯著(P<0.05)低于椰子水，且在浸米水中未檢出果糖和蔗糖。由此可推測，糖類、蛋白質和乙酸含量低是導致以浸米水為原料生產BC產量低的主要原因。

2.2 培養基理化指標與BC產量的相關性分析

根據表1中浸米水和椰子水的組分差異，以及前期關于小分子酸和醇對BC產量影響的研究[17]，對發酵培養基中不同組分和BC產量進行偏相關分析。從表2可以看出，乙酸、葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性固形物和總蛋白含量與BC產量之間呈極顯著(P<0.01)正相關(|r|>0.8)，乳酸含量與BC產量相關性較高但不顯著(0.5<|r|<0.8)，而乙醇含量與BC產量的相關性低(|r|<0.5)。不同組分之間的相關性差異較大，乙酸含量、葡萄糖含量、果糖含量、蔗糖含量、可溶性固形物含量相互間呈極顯著(P<0.01)正相關(|r|>0.8)，而其他組分的相關性不高(|r|<0.8)。

表1 浸米水與椰子水的理化指標比較

Table1Comparison of some physicochemical parameters of rice milk and natually fermented coconut water

檢測指標Test index浸米水Rice milk椰子水Coconut waterpH3.7±0.53.6±0.4乳酸Lactic acid/(g·L-1)10.9±1.19.4±1.7乙酸Acetic acid/(g·L-1)3.2±0.67.0±0.9?乙醇Ethanol/(g·L-1)1.0±0.31.1±0.3葡萄糖Glucose/(g·L-1)2.2±0.57.2±1.4?果糖Fructose/(g·L-1)—6.2±0.5蔗糖Sucrose/(g·L-1)—8.7±1.7可溶性固形物Soluble solids/%2.7±0.69.2±1.2?總蛋白Total protein/(g·L-1)7.7±1.411.0±1.2?

—表示未檢出；*表示差異顯著(P<0.05)。

—， Not detected; *， Significant difference atP<0.05.

2.3 不同碳源和氮源對BC產量的影響

如圖1所示，BC產量隨著碳源濃度的增加逐漸升高，但增速逐漸減小。以果糖為碳源時BC產量最高，其次是葡萄糖，再次為蔗糖，而以甘露糖和麥芽糖為碳源時BC產量最低。當果糖和葡萄糖添加量為35.0 g·L-1時，BC產量最高，且兩者無顯著差異。以蔗糖為碳源，當添加量為30.0 g·L-1時，BC產量最大，但低于以葡萄糖為碳源時的BC產量。果糖、葡萄糖和蔗糖均直接影響可溶性固形物含量，它們均可作為發酵培養基中G.xylinus發酵BC的外源碳源，這與表2相關性分析的結果一致。綜合考慮BC產量和原料成本，選擇葡萄糖作為以浸米水為原料生產BC的碳源，添加量為35.0 g·L-1。

表2 培養基理化指標之間及其與BC產量的偏相關系數(r)

Table2Partial correlation coefficients (r) within different indexes and BC yield

指標IndexpH乳酸Lactic acid乙酸Acetic acid乙醇Ethanol葡萄糖Glucose果糖Fructose蔗糖Sucrose可溶性固形物Soluble solid總蛋白Total protein乳酸Lactic acid-0.606乙酸Acetic acid-0.318-0.255乙醇Ethanol0.648-0.191-0.341葡萄糖Glucose-0.275-0.2530.994??0.017果糖Fructose-0.075-0.4650.968??0.1780.971??蔗糖Sucrose-0.141-0.3660.980??0.1040.990??0.992??可溶性固形物-0.180-0.3510.975??0.1180.982??0.985??0.988??Soluble solid總蛋白Total protein0.418-0.8720.6550.6920.6690.7050.7480.728BC產量BC yield0.419-0.5820.928??0.2950.926??0.987??0.961??0.962??0.868??

*，P<0.05；**，P<0.01。

無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖2-A同。Marks without the same letters indicated significant difference at P<0.05. The same as in Fig. 2-A.圖1 不同碳源對BC產量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on BC production

2.3.2 不同氮源對BC產量的影響

從圖2-A可以看出，有機氮源(蛋白胨和酵母浸提物)比無機氮源[(NH4)2SO4和(NH4)2HPO4]更適于BC生產，且添加蛋白胨和酵母浸提物條件下的BC產量相差不大。

蛋白胨和酵母浸提物中含有不同種類的多肽、維生素、氨基酸和生長因子，兩者混合添加可為菌體生長和BC生產提供更全面的營養。如圖2-B所示，將蛋白胨和酵母浸提物以質量比1∶1混合添加時，BC產量隨著添加量的增加先逐漸增加后趨于平穩，最大產量(2.3 g·L-1)高于單獨添加蛋白胨或酵母浸提物條件下的BC產量，最適添加量為蛋白胨和酵母浸提物各3.0 g·L-1。

結合前期研究，在浸米水中按照最適量添加碳源、氮源，以及對BC生產具有顯著促進作用的增效因子(2.0 g·L-1乙酸和20.0 g·L-1乙醇)[17]，在此條件下，BC產量達到9.3 g·L-1(圖3)，雖然與工業生產中以椰子水為原料生產BC的產量相比仍有顯著(P<0.05)差異，但已較為接近。

2.4 以浸米水和椰子水為原料生產BC的理化性狀對比

2.4.1 物理性質

BC是具有納米孔徑微結構的親水性材料，水分子會被截留在孔隙中，因此會表現出一定的含水量和持水力[18-19]。經過培養基組分優化后，以浸米水為原料生產的BC的常規物理性質如表3所示。可以看出，以浸米水為原料生產的BC的含水量和持水力略低于以椰子水為原料生產的BC，但硬度略高。方差分析結果顯示，兩者各指標均無顯著差異。

2.4.2 微結構

以浸米水為原料生產的BC的微結構如圖4-A所示，BC基本組成單元為200 nm左右的纖維束，纖維束無規則地相互纏繞，交織形成網狀結構，逐漸積累形成BC凝膠膜，與工業生產中以椰子水為原料生產的BC的微結構相似(圖4-B)。但是，以浸米水為原料生產的BC中微纖維排列更緊密，孔隙更細小，與表3中含水量、持水力和硬度的差異變化一致。

2.4.3 紅外光譜

圖B中柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Bars in part B marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05. The same as below.圖2 不同氮源(A)和氮源組合(B)對BC產量的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources (A) and nitrogen sources combination (B) on BC yield

圖3 以不同原料配制培養基的BC產量Fig.3 BC production based on media with different materials

表3 以浸米水和椰子水為原料生產的BC的物理性質比較

Table3Physical characteristics comparison of BCs produced from rice milk and coconut water

性質Characteristics浸米水Rice milk 椰子水Coconut water含水量Water content/%99.0±0.399.3±0.1持水力Water holding capacity/%134.2±17.7146.3±21.7硬度Hardness/N2.7±0.32.6±0.2CrI/%82.7±1.384.6±1.4

圖4 以浸米水(A)和椰子水(B)為原料生產的BC的微結構Fig.4 Micro-structure of BCs produced from rice milk (A) and coconut water (B)

圖5 以浸米水(A)和椰子水(B)為原料生產的BC的傅里葉紅外光譜圖Fig.5 Infrared Fourier transform spectrograms of BCs produced from rice milk (A) and coconut water (B) media

2.4.4 X-射線衍射圖譜

如圖6所示，以浸米水和椰子水為原料生產的BC的X-射線衍射圖譜中衍射峰的位置和形狀相同：在衍射角2θ為14.5°和22.7°處有2個比較強的衍射峰，在16.8°處有一個較弱的衍射峰，表明2種原料生產的BC均屬于I型纖維素[21]。利用MDI Jade計算2θ為14.5°、16.8°和22.7°處3個衍射峰的晶面指數，分別為(100)、(010)和(110)，表明G.xylinus以浸米水和椰子水為原料生產的BC均屬于Iα型纖維素[21]。以浸米水和椰子水為原料生產的BC的結晶度相差不大，分別為82.7%和84.6%。

圖6 以浸米水和椰子水為原料生產的BC的X-射線衍射圖譜Fig.6 X-ray diffraction spectrograms of BCs produced from rice milk and coconut water

3 討論

本研究表明，浸米水中對BC產量有顯著影響的因素為葡萄糖、果糖、蔗糖、乙酸、可溶性固形物和總蛋白含量。乙醇雖然可以大幅提高BC產量[17]，但與BC產量相關性很低(|r|<0.5)，間接表明乙醇并不直接參與BC合成。Naritomi等[22]和Zhong等[23]的研究也表明，乙醇主要用于提供能量或被轉化為乙酸用于BC合成。偏相關系數是在排除了其他變量的影響下兩變量間的相關系數，若2個變量的相關性很高，表明它們屬于同類變量。因此，乙酸與果糖、葡萄糖和蔗糖均可作為BC合成的碳源，這與已報道的結果一致[24]。但是，乙酸添加過多會使培養基pH值過低，菌體活性受到抑制，進而導致BC產量下降[25]，因此，應將乙酸含量視為獨立影響因素進行考慮。

BC微結構孔隙大小隨纖維束的數量多少和直徑粗細而不同，決定了BC含水量和持水力的差異[18-19]。以浸米水和椰子水為原料生產的BC的微結構和結晶度略有差異，但其化學組成相同，均為Iα型纖維素，與已有研究一致[21，26]。影響BC微結構和結晶度的因素主要為菌種、培養基組分和發酵條件[3，27]。靜置培養時BC通常為光滑片狀，振蕩培養時BC為絮狀或球狀，而后者的結晶度和機械強度均低于前者[1]。Bi等[28]發現，在相同培養條件下，不同發酵菌株所產的BC形態不同，導致其結晶度出現差異。由此推測，本研究中BC微結構和結晶度的差異是由原料中的組分差異造成的。這也表明，可通過改變培養基組分來調控BC的微結構和結晶度，進而調控BC的物化性質。Dayal等[3]的研究表明，向BC發酵培養基中添加果膠和明膠均可提高BC的壓縮模量和彈性模量，而添加羧甲基纖維素鈉和果膠則會降低BC的結晶度。BC的性質決定了其應用方向，可根據用途不同，在BC發酵過程中或發酵結束之后添加適量調節劑對BC的結構進行修飾，從而改變其性質，以用于電子、醫藥等行業，及用作抗菌包裝等新材料[1，8，29]。

目前，生產原料不足嚴重制約了我國BC產業的發展。本研究中，雖然以浸米水為原料生產BC的產量低于以椰子水為原料生產BC的產量，但我國浸米水量大而集中，因此仍具有一定的工業化推廣前景。以浸米水為原料生產BC，不僅可提高我國BC產量，滿足不斷增加的需求，還可降低BC生產成本，解決浸米水無法得到有效利用的問題。鑒于不同領域的材料對BC的性質要求差異較大，后期還需要深入研究以浸米水為原料生產的BC的晶型結構、熱性能、拉伸性等性能，探究影響BC結構和物化性質的因素及其調控方式。