浙茄類型茄子品種DNA指紋圖譜構建

魏慶鎮，王五宏，胡天華，胡海嬌，汪精磊，包崇來

(浙江省農業科學研究院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

茄子(SolanommelongenaL.，2n=24)是茄科(Solanaceae)茄屬(Solanum)的一種蔬菜作物，具有重要的農業經濟價值和保健作用[1]。茄子具有十分豐富的生物多樣性和廣泛的地理分布，在生長習性、抗病抗逆、果實形狀和顏色上存在較大變異[1-3]。據聯合國糧食及農業組織(FAO)統計，2017年全世界茄子產量為5 230.9萬t，而中國的產量達到3 290.8萬t，占全世界產量的62.9%，我國已成為茄子世界第一生產國和主要出口國。茄子栽培種因區域消費習慣的不同，差異較大，但是相同區域內茄子品種卻非常相近[4-5]；浙江省主要栽培紫紅線茄，茄子紫紅色，細長，一般30 cm左右，橫徑2.5～3.5 cm，近年來涌現出一系列浙茄品種，如浙茄1號、浙茄3號、浙茄8號、杭豐、杭茄2010等[6-9]，浙茄系列品種形態學性狀非常相似，從性狀上統計鑒定有一定難度，而且形態學性狀容易受環境影響，在種子市場上同名異物及同物異名的情況經常發生，給育種單位和育種人員造成重要的經濟損失。因此，對不同的品種進行快速準確地鑒定，不僅可以辨別品種的真假，同時對解決產權糾紛具有重要意義。

DNA指紋圖譜技術已廣泛應用于作物的品種資源多樣性和純度鑒定研究中[10-13]。1986年，Jeffreys發明了DNA指紋圖譜技術(DNA-fingerprinting)，成為品種和品系鑒別的重要方法，且具有高效、準確等優點。近幾十年，隨著分子生物學的發展，分子標記技術成為鑒定品種的重要手段，用于DNA指紋圖譜的標記類型也在不斷更新，從傳統的限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、隨機擴增多態性(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)標記，發展到簡單重復序列標記(simple sequence repeat，SSR)，最新應用較多的是單核苷酸多態性標記(single nucleotide polymorphism，SNP)。SSR標記已在許多作物指紋圖譜構建中得到應用，宋海斌等[14]利用SSR引物對不同甜瓜品種組合進行了指紋圖譜構建；董志剛等[15]利用15對SSR引物區分了16份葡萄品種與親本。此外，SSR標記也在獼猴桃、柑橘、玉米等作物上得到應用[16-18]。傳統標記具有多態性低，對變異反應較敏感等缺點，SNP標記作為第三代分子標記，具有數量多、分布廣泛、二態性、很容易進行高通量檢測的優點。目前，SNP標記是國際植物新品種權保護聯盟分子測試指南中構建DNA指紋數據庫的推薦標記之一[8]，王大莉[19]通過對功能基因SNP進行分析，構建了22個香菇栽培種的SNP指紋圖譜；張昆鵬[20]利用SSR標記和SNP標記分別構建了油菜品種的指紋圖譜并做了比較，發現SNP標記的結果更可靠；李志遠等[11]開發篩選獲得甘藍50個核心SNP標記，并利用這些標記構建了甘藍主要品種的指紋圖譜，SNP標記已經在指紋圖譜構建中凸顯出越來越重要的地位。競爭性等位基因特異性PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)是一種新型高通量SNP分型方法，該方法成本低、準確度高，更具SNP位點適用性，已經在水稻、小麥、大豆等作物中得到廣泛應用[21-23]。

目前，茄子還未見開發標記并用于構建指紋圖譜的報道，本研究利用北京農林科學院前期開發的48個核心SNP標記，利用KASP技術對46份茄子材料進行基因分型，根據標記分型結果、多態性信息含量篩選獲得34個核心SNP標記，并用于浙茄系列品種的指紋圖譜構建，為浙茄品種真實性、特異性鑒定提供重要依據，為品種保護提供了重要的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料是浙江省農業科學院茄子研究室收集，包含3份野生自交系材料，37份自交系材料，6份雜種F1。各材料于2018年11月播種，穴盤育苗后，移栽到小號營養缽中，于2019年4月定植于浙江省農業科學院喬司實驗基地大棚溫室，株距20 cm，行距80 cm。利用所有材料對48個SNP標記進行分型，篩選核心標記后，對品種進行指紋圖譜構建。

1.2 DNA提取

取茄子幼嫩葉片直接放入2.0 mL離心管中，用液氮速凍，然后利用DNAsecure試劑盒提取DNA，提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶明亮單一無污染，利用Nanodrop2100檢測D260/D280，在1.8～2.0(DNA樣品沒有蛋白污染)；D260/D230在1.8～2.0(DNA樣品鹽離子濃度低)；270 nm沒有明顯的光吸收(DNA樣品沒有酚污染)。根據英國LGC公司的KASP檢測技術和基因組大小換算出DNA用量為每樣品10～20 ng，稀釋DNA濃度成為10～20 ng·μL-1備用。

1.3 KASP標記開發

1.3.1 引物的合成和引物預混液的配制

SNP標記由北京市農林科學院蔬菜研究中心提供，標記是利用茄子參考基因組數據開發，經過篩選后獲得的48個核心標記。SNP引物由北京生工生物工程有限公司合成，每組引物中的引物A1的序列的5′端加上接頭序列：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，引物A2的序列的5′端加上接頭序列：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，引物C的序列不用改變。分別將各組SNP引物中的引物鏈均稀釋成10 μmol·L-1，并按照體積比為12∶12∶30(引物A1∶引物A2∶引物C)的比例混勻，分別得到引物預混液。

1.3.2 基因分型

利用KASP技術對46份茄子進行SNP基因分型，SNP基因分型過程按照LGC公司提供的KASP技術實驗流程進行，試驗涉及的試劑、耗材和儀器均由LGC公司提供，整個實驗步驟和試劑用法用量均按照LGC公司的操作指南KASP user guideand manual(www.lgcgenomics.com)進行。具體步驟如下：首先利用K-pette分液工作站將稀釋好的待測DNA模板(4～10 ng·μL-1)1.5 μL和空白對照(no template control，NTC)分別加入反應板孔中，60 ℃烘干30 min(干燥箱，LGC公司)，DNA變成干粉備用。然后在Kraken操作系統下利用Meridian加樣工作站分別向每個反應孔中加入1×Master mix與引物混合液，Mix分裝完畢立即將微孔板依次放在Kube熱封儀和Fusion激光封膜儀上封膜，利用Hydrocyler進行高通量水浴PCR擴增。

PCR反應在高通量水浴系統Hydrocycler中進行，具體程序為94 ℃預變性，15 min；94 ℃，20 s(變性)，61 ℃-55 ℃，1 min(復性和延伸：以touch down 程序擴增10個循環，每循環降低0.6 ℃)；94 ℃，20 s(變性)，55 ℃，60 s繼續擴增26個循環。擴增結束后，利用BMG PHERAstar儀器檢測熒光信號并查看分型情況。若分型不充分，則繼續擴增，每3個循環查看分型情況，直至分型完全，從Kraken軟件中導出實驗結果。

1.4 數據處理

根據分型結果，利用Excel 2010計算每個標記的等位基因頻率，并計算各標記的多態性信息含量，計算公式為PIC=1-∑fi2，其中fi為i位點基因頻率。根據SNP標記的二態性特點，將分型數據轉化為二元編碼數據，其中按照茄子品種名稱順序，首次出現的純合基因型記為(1 0)，雜合基因型記為(1 1)，另一種純合基因型記為(0 1)，構建6個浙茄品種的指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 SNP標記的基因分型

在所有標記基因分型結果中，將所有46種茄子全部成功分型的標記有9個，有11個標記在45種茄子材料中成功分型，圖1為SNP分型結果示意圖。但有部分標記分型結果較差，例如標記SmSNP007在8個材料上未成功分型，其次是標記SmSNP031，有6個材料未成功分型，有9個標記在超過3個材料上未成功分型；有6個標記SmSNP021、SmSNP024、SmSNP168、SmSNP186、SmSNP201、SmSNP217均不能在3個野生材料上獲得明確的分型結果，標記SmSNP045、SmSNP089、SmSNP091、SmSNP112、SmSNP173均只能成功分型1個野生材料，推測這些標記對野生材料的分型的概率比較小，不能應用于野生茄子材料的基因分型。

每個圓點代表一份測試材料；a.標記SmSNP011分型：紅色圓點，A∶A；綠色圓點，A∶T；藍色圓點，T∶T。b.標記SmSNP196分型：紅色圓點，C∶C；綠色圓點，C∶T；藍色圓點，T∶T；粉色圓點，未成功分型。Each dot represented a test material. a. SmSNP011 genotyping: red dots， A∶A; Green dots， A∶T; Blue dots， T∶T; b. SmSNP196 genotyping: Red dots， C∶C; Green dots， C∶T; Blue dots， T∶T; Pink dots， the ungenotyped.圖1 SNP標記分型示意圖Fig.1 Genotying graph of the SNP marker

2.2 SNP標記的多態性及雜合比例

多態性信息含量(PIC)是衡量標記質量的重要指標。48個標記在46份材料中PIC值最小為0.139，最高為0.500，其中小于0.35的有5個標記，有30個標記PIC值為0.45～0.50，占到所有標記的62.5%，沒有標記的PIC值為0.30～0.35(圖2)。根據將PIC值的分布，將小于0.35的標記剔除，PIC值大于0.35的標記用于后續指紋圖譜的構建。

根據標記分型結果，我們計算了雜合基因型的比例，其中，雜合基因型比例小于5%的有3個標記，大部分標記的雜合基因型的比例為10%～15%，其中標記SmSNP045雜合位點比例高達72%，只有G∶A和G∶G兩種基因型，雜合位點比例較高，不利于后續指紋圖譜的構建，我們將此標記剔除。

2.3 核心SNP標記篩選

根據標記在46份材料上的基因分型結果和PIC值，挑選基因分型數據缺失少于3個，PIC值大于0.35的SNP標記作為核心標記，用于后續6份浙茄材料指紋圖譜構建的核心標記，因為茄子參考基因組是scaffold版本，并不能明確標記在染色體上的位置，所以并不能根據標記的位置分布來篩選標記。綜上，一共剔除了14個SNP標記，剩余34個標記用于后續指紋圖譜構建(表1)。

圖2 SNP標記多態性信息含量分布情況Fig.2 Distribution of polymorphism information of SNP markers

圖3 三十四個標記在46種茄子中的雜合基因型比例Fig.3 Heterozygous genotype ratio of 46 eggplant varieties based on 34 SNPs

2.4 茄子材料的聚類分析

根據34個標記的分型結果，利用NTSYS軟件對46份茄子材料進行聚類分析(圖4)。結果表明，編號1、2、3的野生茄子聚類到一起，其中2和3更為相似；編號43(浙茄8號)和編號44(杭豐1號)更為接近，與編號29聚類為1個分支；編號27和編號45(杭茄2010)以及編號19更為接近，整體上這6個茄子與編號25更為接近；編號42(浙茄3號)和編號46(浙茄10號)相近，它們與編號41(引茄1號)以及編號26歸為一個分支，這與我們浙茄系列品種的親本來源及品種特性相一致，；同時，浙茄類型6個品種均在一個大的亞類內，同屬一個類型。

圖4 四十六個茄子品種的SNP聚類分析圖Fig.4 Clustering analysis dendrogram based on SNP for 46 eggplant varieties

表1 四十六個SNP標記信息

Table1The information of 46 SNP markers

標記名稱序列信息多態性信雜合位點比例未分型數目MarkernameSequence息含量PIC valueHeterozygousgenotype ratioNumber ofungenotypedSmSNP001TCATTGTACTAGCCG[A/T]ATTATTGAAGTTCT0.474 0.273 2SmSNP002CAACACATTAGTAAC[C/T]GGAATAACATTCAT0.491 0.261 0SmSNP003TTTCCCAATGCTATA[A/G]ATGATTTTTCAATC0.369 0.133 1SmSNP004TGATAGTGAGCAAAC[C/A]AGGGTGTTGTTGAC0.464 0.156 1SmSNP005AGGATTAAATGTTGG[C/T]CATGCGAACTCATT0.466 0.217 0SmSNP006CACACAATTGGAAGA[A/G]CAACATGTGAATCA0.485 0.217 0SmSNP007TTGTGAATTAGATTT[T/C]TTATTGATTTACTA0.487 0.243 8SmSNP011ATTATTTGGAGGAAC[T/A]AATGAGGAGAATGG0.491 0.130 0SmSNP012TGTATTGACTATTCT[T/A]ATCTGTTCTGCAGC0.496 0.261 0SmSNP013CAGTGGATTAATGGT[C/G]TGCTTAAAATCAGT0.429 0.267 1SmSNP016TGCCGCGATACCTCT[G/A]CATTTTTACTTTTG0.499 0.130 0SmSNP021TTGCAACTTGTAACT[A/G]TATGATTGAAGCAT0.369 0.209 3SmSNP024TGACTCTAAAGAATT[T/C]ATTAAAAGTTATCC0.363 0.143 4SmSNP027ATCAAGTAACCTGTC[G/A]TTCTTCTCGTTCAG0.415 0.109 0SmSNP030TACAATGAAACAATG[G/T]GAATAGACAAGAAA0.499 0.209 3SmSNP031CTCACAAAATTTCAA[C/T]CCAATTACATTATT0.139 0.100 6SmSNP035TCTGACTAGCGACTA[G/A]TATCATATCCAGAC0.438 0.162 1SmSNP038AGAGATTGAGAGAAC[G/T]CTTCAATCTGCGTT0.425 0.205 2SmSNP042ACTAAATGCAGAGGG[C/T]AAATTAGAGAAGAA0.498 0.222 1SmSNP045GTTTGCATTTGGATT[A/G]ATTTGGAGAATGTT0.461 0.721 3SmSNP055AATCAAGACTCAATC[C/T]CGACCACTTTCTTT0.416 0.136 2SmSNP062CAAATCGCCATAGAC[G/A]ATAACAGGAGCATT0.358 0.156 1SmSNP078TGCGTTGATGAATAA[C/T]GAGTAAGAGATTTT0.473 0.116 3SmSNP089AGTTAATTTATACAT[A/G]TATCCTAGATATAA0.499 0.256 3SmSNP091GCATTCAAGATGACA[T/C]CTAAATAAAATAAA0.500 0.159 2SmSNP094AATTAGGTGGAGAAA[A/G]GAGGACCATACAAT0.483 0.116 3SmSNP097ACCAACAGAAGGTGA[A/G]AATAATCAGTGGAT0.500 0.214 4SmSNP105ACAATCACATACTAC[T/C]ACCTCTCAAAGTCC0.500 0.093 2SmSNP107TGTCAAGTGACACTA[T/C]TTTGTCGAAAAAAA0.449 0.182 2SmSNP112TGTAAGTGGATCCGA[C/T]AAATTATCCTTTGA0.497 0.146 5SmSNP114AATAATGGGTTCGCT[T/C]GTTCAAAATCCCAG0.500 0.119 4SmSNP119ATCAGAGGCGGCAAG[C/T]ATAGCCACTGTTGC0.494 0.152 0SmSNP128TGGGTGCCACTTATT[T/C]CAACATTCTTTGAA0.198 0.044 1SmSNP135GCCATGGCTTCCGGT[G/A]TGTCGTCTGCTGCC0.463 0.045 2SmSNP140GTTTTGAGCCTTCTG[G/T]TTATAGAACATTTA0.442 0.068 2SmSNP142TTGGAGCAGTTCAGC[G/A]CCAAAGTTATGCTT0.500 0.089 1SmSNP146CGAGCCATGTGATTT[G/A]TCTCTGTGATGACC0.247 0.067 1SmSNP151TTATTATTCTAGCTA[T/A]GGAAGGTTTAAATC0.463 0.091 2SmSNP161ACCAGCATGATAAAG[C/T]AAAACCAAATCTAA0.298 0.091 2SmSNP168CCTCGCGGTGCTGTG[A/G]AATCTTCCAGAGAC0.476 0.195 4SmSNP173CTCAAAGTGAATGTC[T/C]TAGCATTACATATT0.487 0.140 3SmSNP186TCATATTCGCACTTA[C/T]ATTAGGATTATCAA0.404 0.122 5SmSNP196GCAAAAAGTTAGTCA[T/C]CAGTAACATGGCAA0.480 0.267 1SmSNP201TTGATTACAAGAAAT[C/T]TATATGATGCACTA0.476 0.098 5SmSNP205TTATTCAACTTGTTC[G/A]TATAGTTCTACTCC0.396 0.152 0SmSNP206AGAAGATAAGATGCA[C/T]ACAATTCATGTCTA0.278 0.022 1SmSNP216AGTTTTAGAAAAAAA[C/A]ATGTTCTTCAGGTT0.494 0.114 2SmSNP217AGCGAAATCTATATA[C/A]AGGAACTGAACAGT0.499 0.163 3

帶陰影標記的是篩選后剔除的標記。

The shaded markers were those markers removed after screening.

2.5 主要品種指紋圖譜構建

利用最終篩選的34個SNP位點用以構建主要茄子品種的指紋圖譜，將6個茄子品種SNP分型轉化為二元編碼數據，得到浙茄品種的指紋圖譜。34個標記中，有13個標記在6種茄子品種基因分型一致，占到38.2%，有7個標記在6種茄子品種只有兩種基因分型，14個標記均出現了3種基因分型，各品種間差異位點數均≥ 2，因此，利用該 DNA 指紋圖譜可對6個茄子品種進行快速有效區分(表2)。

表2 六個浙茄類型茄子的指紋圖譜

Table2SNP-DNA Finger-printing database of 6 eggplant varieties from Zhejiang Province

品種VarietySmSNP001SmSNP002SmSNP003SmSNP004SmSNP005SmSNP006SmSNP011SmSNP012SmSNP013SmSNP016SmSNP021SmSNP027SmSNP030SmSNP035SmSNP038SmSNP042SmSNP055引茄1號1 01 11 11 11 11 11 01 11 01 01 11 01 01 01 11 01 1Yinqie No.1浙茄3號1 11 01 11 11 01 11 01 11 01 01 11 01 01 01 11 11 1Zheqie No.3浙茄8號1 00 11 11 10 11 01 01 01 01 01 01 00 11 11 00 11 0Zheqie No.8杭豐1號1 00 11 11 11 11 11 11 01 01 01 01 01 10 11 01 11 0Hangfeng No.1杭茄20101 00 11 11 11 00 11 00 11 01 01 01 01 00 11 00 11 0Hangqie 2010浙茄10號1 01 11 11 11 00 11 00 11 01 01 11 01 00 11 11 11 1Zheqie No.10品種VarietySmSNP062SmSNP078SmSNP089SmSNP091SmSNP094SmSNP105SmSNP107SmSNP119SmSNP135SmSNP140SmSNP142SmSNP151SmSNP173SmSNP196SmSNP205SmSNP216SmSNP217引茄1號1 01 01 11 11 11 11 11 01 01 01 01 01 11 01 01 01 1Yinqie No.1浙茄3號1 01 01 11 01 01 11 01 01 01 01 01 01 01 11 11 01 1Zheqie No.3浙茄8號1 01 01 01 10 11 11 11 01 01 01 01 00 11 11 11 01 0Zheqie No.8杭豐1號1 01 01 00 10 11 11 11 01 01 01 01 00 11 11 11 01 1Hangfeng No.1杭茄20101 01 00 10 11 01 11 01 01 01 01 01 00 10 10 11 00 1Hangqie 2010浙茄10號1 01 01 11 11 01 11 01 01 01 01 11 01 11 11 11 00 1zheqie No.10

3 結論與討論

雖然不同地域茄子品種差異很大，但是同一地區的茄子品種很難從形態學性狀方面準確區分；浙茄系列品種均屬于紅茄線茄類型，在長度、橫徑、顏色方面差異很小，再加上茄子品種在銷售過程中經常會出現同物異名的現象，使得品種鑒定保護成為重要的一環。

SSR標記已在多種作物指紋圖譜構建中得到應用，但是隨著標記檢測成本的降低，SNP標記逐步用于指紋圖譜的構建中。目前，相對于SSR標記，高通量大樣本的SNP標記檢測已顯現出優勢；李志遠等[11]利用開發的2.54×106個SNP標記，成功篩選出50個核心SNP標記，構建了59個甘藍品種的指紋圖譜；顧炳朝等[13]采用芯片技術開發SNP，構建了鎮油6號的指紋圖譜，并發現SNP標記指紋圖譜所含差異位點信息較多，比SSR標記圖譜更好，同時，研究發現SNP標記構建的指紋圖譜具有數量多、分布廣泛、高通量的優點[24]。目前，SNP檢測及分型的方法有很多種，例如基于凝膠電泳檢測的等位基因特異性PCR[25]、酶切擴增多態性序列法[26]、DNA芯片技術[27]和KASP技術[28]等。張昆鵬等[20]利用DNA 芯片技術檢測SNP，構建了油菜的指紋圖譜；Tian等[29]利用DNA芯片技術構建了玉米的指紋圖譜構；趙勇等[23]采用測序法、酶切擴增多態性序列法和KASP法對大豆Dt1基因的4個SNP進行分型，發現KASP法是大豆快速、高效的SNP分型方法。相對于其他SNP檢測方法，KASP 技術具有靈活、經濟、準確的特點，優勢明顯，被廣泛應用于各個領域。今后隨著品種數量的增多、品種指紋圖譜數據庫的進一步豐富，高通量的SNP檢測技術在新育成品種的真實性、特異性鑒定方面將具有非常廣闊的應用前景。

本研究利用了北京農林科學院開發的48個核心SNP標記，利用KASP技術，經過46份茄子材料的再次篩選，最終獲得34個高質量SNP標記，并利用這些核心標記構建了浙茄類型6個品種的指紋圖譜，通過指紋圖譜有效地區分6個品種類型的茄子，對浙茄類型的品種鑒定保護起到了積極作用，有助于茄子種子市場的監管監督。浙茄類型品種豐富，遠不止6個品種，從長遠考慮應當對不同類型的茄子品種材料和育種親本進行重測序，結合參考基因組數據，開發大量SNP標記，然后結合分型結果、PIC值、在染色體上的分布等情況篩選更多的核心標記用于指紋圖譜的構建。同時，由于全國范圍內各省市茄子的差異，應當搜集更多的不同類型茄子資源材料、品種、育種親本等，開發更多核心SNP標記且通用于不同類型的茄子，構建更加全面的茄子指紋圖譜，以此來快速鑒別鑒定茄子品種，提高種子市場規范。

致謝：感謝北京市農林科學院蔬菜研究中心在SNP標記開發和分型方面提供的幫助，感謝李志遠博士在指紋圖譜構建方面提供的幫助。