水稻葉片無機磷測定影響因素探究

徐紀明，毛文軒，何秋菊，姜小燕，毛傳澡

(浙江大學 生命科學學院，浙江 杭州 310058)

磷是植物生長發育所必需的大量礦質營養元素，由于其在土壤中的含量較低，已成為影響作物產量的重要因素。隨著人口數量的增加，糧食的需求也在同步增加。當前作物的高產很大程度上依賴于磷肥等肥料的大量施用。但是，只有大約10%～25%的磷肥能夠被當季作物吸收利用，其余的磷肥則被土壤固定或進入水體并導致環境污染[1]。水稻作為我國主要糧食作物之一，其產量的穩定提升是國家糧食安全的重要保障。研究水稻磷吸收利用的分子生理機制，對于提高水稻磷養分吸收利用效率，培育磷高效水稻品種有重要意義[2]。

無機磷含量是分析水稻磷吸收代謝能力的重要指標。無機磷的測定是水稻磷相關研究的必要方法，在突變體篩選、功能基因研究與品種磷效率評價等方面發揮著重要作用，其準確性將直接影響相關的研究結論。目前，水稻中克隆的一系列磷吸收、代謝調控過程中的關鍵基因，如PHR2、PHF1、SPX家族基因、PHO1、PHO2、PTs等的增強表達或突變體材料中無機磷濃度都發生了相應的變化[3-5]。其中，PHO1、PHO2和PHF1都是通過測定突變體無機磷濃度篩選得到并定位克隆的[5-7]，而其他磷相關基因的功能研究也都離不開無機磷含量的測定[8-10]。

水稻無機磷的測定方法主要有孔雀綠法和鉬藍法[11-13]等，測定方法簡單，穩定。但是在實際的無機磷測定過程中，尤其是在取樣過程中，會遇到一系列的問題，如不同批次取樣時間不同，同批次測定樣品數量大、延續時間長、樣品存放條件不同，田間取樣如何存放，不同取樣部位是否對測定結果產生影響等等。闡明無機磷測定過程中的各種條件因子對無機磷濃度測定結果的影響對磷相關研究具有重要的意義。本研究以野生型水稻日本晴(OryzasativaL. ssp.Japonicacv. Nipponbare)作為研究對象，研究了取樣部位、取樣時間、保存條件和保存時間對無機磷測定結果的影響，以期為水稻和植物磷脅迫適應機制的研究和磷高效作物新品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用水稻品種日本晴(OryzasativaL. ssp.Japonicacv. Nipponbare)由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 水稻培養

野生型水稻Nipponbare種子用自來水洗凈后，用體積分數0.7% HNO3破休眠處理18 h，37 ℃暗處催芽2 d至露白，將露白的種子播于浮在水稻培養液的網紗上。培養液中各成分為：0.091 mmol·L-1KNO3，0.183 mmol·L-1Ca(NO3)2，0.274 mmol·L-1MgSO4，0.183 mmol·L-1(NH4)2SO4，200 mol·L-1KH2PO4，1.0 mol·L-1MnCl2，3 mmol·L-1H3BO3，0.1 mol·L-1(NH4)6Mo7O24，0.4 mol·L-1ZnSO4，0.2 mol·L-1CuSO4，80 mol·L-1NaFe(Ⅲ)-EDTA，2 mmol·L-1MES (pH 5.5)，所有試劑購自國藥集團(分析純)，在水稻生長室中培養7 d后移到50 L水槽中繼續培養，3 d更換一次營養液，水稻苗間距為3 cm。水稻培養條件：07:00至19:00溫度30 ℃，19:00至07:00溫度22 ℃；環境相對濕度(Rh)為80%，光照強度24 000～36 000 lx。

盆栽采用統一規格的塑料桶，將均勻拌好肥料(氮肥用量為純N 0.2 g·kg-1土，磷肥用量為P2O50.15 g·kg-1土，鉀肥用量為K2O 0.15 g·kg-1土)的土壤按10 kg每桶進行分裝。然后，將在營養液里生長約2周的野生型水稻移栽至土中，進行淹水栽培，每桶1株，共10桶。分別取抽穗5 d(移栽75 d)和25 d(移栽95 d)的植株旗葉進行無機磷測定。樣本統計數為5。

1.2.2 葉片無機磷提取

取水稻葉片并剪碎，放入已稱量的2 mL離心管中，并稱量，樣品與離心管總質量減去離心管質量得到樣品質量，樣品質量以50～100 mg為宜。離心管中加入氧化鋯珠子(直徑5 mm)和0.5 mL 5 mol·L-1H2SO4，使用球磨儀破碎勻漿后，轉移到15 mL離心管中，并加入5 mL去離子水混勻，使用Whatman定量分析濾紙過濾后進行無機磷濃度測定。

1.2.3 連續流動分析儀測定無機磷濃度

使用連續流動分析儀測定水稻葉片無機磷濃度[14]。連續流動分析儀為荷蘭SKALAR分析儀器公司SAN++三通道連續流動分析儀。用含2 000 mg·L-1P的KH2PO4標準磷溶液進行稀釋，分別制成1.25、2.50、5.00、10.00、20.00和30.00 mg·L-1P的標準系列溶液。

1.2.4 取樣時間

在分析同一天內不同時間對磷濃度的影響時，取樣時間設置起始時間為07∶00，每隔3 h取一次樣品，共取8次，取倒二葉作為測定對象。其他測定的取樣時間為10∶00。

1.2.5 取樣部位

野生型水稻長至21 d苗齡時，最新一片完全展開葉為倒一葉。不同葉片無機磷濃度分析時，分別取倒一葉、倒二葉、倒三葉和倒四葉進行無機磷測定；葉片不同部位無機磷濃度分析時，取倒二葉作為測定對象。測定不同苗齡葉片無機磷時，取21、31、41 d苗齡的野生型倒二葉作為測定對象。測定開花前和開花后20 d的旗葉無機磷濃度時，以盆栽種植的野生型水稻旗葉作為測定對象。

1.2.6 鮮樣的保存條件和保存時間

在分析保存條件和保存時間對無機磷測定的影響時，將含有水稻葉片的離心管在室溫(25 ℃)和低溫(4 ℃)條件下放置0、4、8、12、24 h后，進行無機磷測定。

1.2.7 統計分析

采用SPSS18 軟件進行單因素方差分析(Duncan)。

2 結果與分析

2.1 取樣時間對無機磷含量的影響

數據為3次重復的平均值±標準差。數據以鮮質量計。下同。Results were shown as Data was detected based on fresh weight. The same as below.圖1 不同取樣時間對無機磷測定的影響Fig.1 Inorganic phosphate concentration of leaves sampled at different times

為確定取樣時間對水稻葉片無機磷含量的影響，分析了一天內不同時間點取樣樣品的無機磷濃度。結果如圖1所示，一天內不同時間點的葉片無機磷含量有波動，但是每個時間點之間并沒有顯著差異。說明一天內不同時間點取樣對水稻葉片無機磷含量沒有影響。

2.2 不同取樣部位對無機磷含量的影響

對營養液培養的21 d苗齡野生型水稻倒一、倒二、倒三和倒四葉的無機磷濃度進行了分析，結果如圖2所示。水稻不同部位葉片的無機磷含量差異顯著，其中倒一葉無機磷含量最低，為0.69 mg·g-1，倒二葉無機磷含量為1.0 mg·g-1左右，倒三葉無機磷含量為1.16 mg·g-1，顯著高于倒二葉(P<0.05)，倒四葉無機磷含量最高，為1.30 mg·g-1。

為分析相同葉片不同部位無機磷含量是否存在差異，將野生型倒二葉分成3段，分別為葉尖、葉中部和葉基部，測定結果發現，葉中部無機磷含量比葉尖濃度稍高，但是沒有顯著差異(P>0.05)，葉基部無機磷含量最低，比葉中部無機磷含量低19%，且差異顯著(P<0.05)。

以上結果說明，不同葉序水稻葉片無機磷含量差異較大，顯示為新葉低，老葉高的趨勢，而且同一葉片不同部位無機磷含量也有差異，葉基部相對較低。

2.3 不同苗齡對無機磷含量的影響

不同苗齡水稻倒二葉的無機磷含量變化不大，均為1 mg·g-1左右(圖4-A)，說明水培條件下不同苗齡水稻葉片無機磷含量保持穩定，不隨著葉齡變化而發生波動。開花后水稻籽粒進行灌漿，而灌漿所需的養分大部分來自于旗葉，為確定開花前后旗葉無機磷含量的變化，分別取開花前和開花后旗葉進行無機磷含量測定。結果表明：開花前旗葉無機磷含量為0.47 mg·g-1；開花20 d后，灌漿完成，旗葉無機磷含量下降至0.23 mg·g-1(圖4-B)。

柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05.圖2 不同取樣部位對水稻葉片無機磷含量的影響Fig.2 Inorganic phosphate concentration of different leaves and different tissues in a same leaf

數據為5次重復的平均值 ± 標準差，**表示兩樣本之間存在極顯著差異(P<0.01)。下同。Results were shown as ±s(n=5). ** meant significant difference at the level of P<0.01. The same as below.圖3 不同苗齡葉片無機磷含量Fig.3 Inorganic phosphate concentration of leaves at different ages

2.4 取樣后保存條件和時間對無機磷含量的影響

無論是室溫還是低溫條件，經過不同時間放置后，葉片無機磷含量與放置0 h的含量沒有顯著差異，均為1 mg·g-1左右。說明在取樣后24 h之內，不同保存溫度下葉片無機磷含量沒有顯著差異；而且2個不同保存溫度下放置不同時間，葉片無機磷含量也沒有顯著差異，說明相對于低溫條件(4 ℃)，室溫保存(25 ℃)對水稻葉片無機磷含量沒有影響。

圖4 保存溫度和時間對水稻葉片無機磷含量的影響Fig.4 Effect of preservation temperature and time on inorganic phosphate concentration of leaves

3 討論

無機磷濃度是研究水稻磷吸收、代謝過程非常重要的指標，反映了水稻對磷的吸收、代謝和轉運等能力，在突變體篩選、基因功能研究與遺傳育種材料的篩選評價中有重要的指導意義，其測定的準確性直接影響人們對相關材料和相關基因功能的評價結果。本研究詳細分析了不同取樣時間、取樣部位、保存條件和保存時間，以及苗齡對水稻無機磷含量的影響，結果表明，不同取樣部位會對無機磷含量產生顯著影響，而不同取樣時間、取樣后在室溫或者低溫下短期保存(24 h內)均對無機磷含量沒有影響；不同苗齡對葉片無機磷含量沒有影響，而開花前后旗葉無機磷含量會發生顯著變化。

磷是可再利用元素，老葉中的磷可經過葉鞘、節等組織轉移到新葉中[15]。磷在轉運過程中是以無機磷的形式，通過磷轉運蛋白轉運，因此，老葉中無機磷濃度高于新葉，而新葉代謝旺盛，大量的磷被代謝利用，合成核酸、磷脂和核蛋白等物質，導致無機磷含量相對較低。對大麥不同葉片無機磷測定結果顯示，從新葉到老葉，無機磷含量逐漸升高[16]，本研究結果與此一致，而且本研究中葉片不同部位無機磷含量也不相同，這也可能是因為葉中部和葉尖代謝旺盛，光合作用強烈，因此需要穩定、較高的無機磷濃度的保證，而葉基部細胞結構特化，代謝較弱，要負責無機磷的運進和運出，因此無機磷含量相對較低；另外，老葉中的磷會通過葉基部轉運到更新的葉片中利用，這也可能是葉尖磷含量高于葉基部的原因。不同苗齡葉片無機磷測定結果顯示，不同苗期葉片無機磷含量變化不大，開花20 d后，葉片無機磷主要轉移到種子中，因而開花20 d后旗葉無機磷含量顯著降低。根據上述結果，測磷含量時要固定取樣部位，可選擇倒二葉進行測定[17]，而且取樣部位要一致，這樣才能進行不同材料或不同處理之間磷含量的比較。

在水稻無機磷測定過程中，有時會遇到測定樣品數量很大，或者異地取樣，造成樣品不能及時測定，一方面會導致取樣時間不同，另一方面樣品儲存時間也不同，儲存溫度條件也會波動。本研究顯示，24 h內不同時間取樣對無機磷測定結果沒有影響，不同時間點葉片無機磷含量也沒有顯著差異。取樣完畢將樣品放到離心管后，室溫或者低溫條件放置24 h對測定結果不會產生顯著影響。首先因為離心管密封性好，放置過程中不會因為水分流失而對質量產生影響，其次可能是因為倒二葉已經發育成熟，葉片細胞內無機磷的消耗和產生達到平衡，取樣后24 h內，無機磷濃度不會產生大的變化。具體原因需要進一步研究確定。

本研究分析了取樣部位、取樣時間、保存條件、保存時間與苗齡等因素對水稻無機磷測定的影響，結果表明，取樣部位對無機磷測定結果影響較大，其他因素對結果沒有影響。在無機磷測定時需要主要注意取樣部位，按照本研究提供的方法，能得到準確、一致的結果。本研究使用的材料為野生型水稻品種日本晴，在使用其他水稻品種或者其他植物，如玉米、小麥、煙草等進行磷代謝相關研究中，也需要注意取樣部位不同對無機磷含量測定帶來的影響。