牛病毒性腹瀉病毒Core蛋白的原核表達及多克隆抗體制備

張 康，張 璇，閆遵祥，王 磊，張 凱，張景艷，羅永江，仇正英，薛 歡，李建喜，*

(1.中國農業科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所/農業農村部獸用藥物創新重點實驗室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅 蘭州730050；2.蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050；3.西安交通大學 基礎醫學院，陜西 西安 710061)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhoea viruses，BVDV)是黃病毒科瘟病毒屬的成員，其結構是單股正鏈RNA基因組，大小約為12.3 kb[1-2]。BVDV通過網格蛋白介導的內吞作用進入宿主細胞，在病毒和宿主的蛋白酶共同水解和切割作用下，會形成12種成熟蛋白，包括P14(Core)、gp48(Erns)、gp25(E1)和gp53(E2) 4種結構蛋白和Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[3]8種非結構蛋白。目前該病毒在世界范圍內廣泛分布，許多養牛業發達國家也有廣泛流行，嚴重影響養牛業的發展[4-7]。Core蛋白是由糖胺聚糖共價結合組成的多肽鏈，在病毒侵染宿主細胞的過程中起重要作用[8]。成熟的Core蛋白以病毒粒子結合形式存在，由90個氨基酸組成，并通過3種酶的作用將其從多聚蛋白鏈中切割下來。其中，Npro通過共翻譯自身蛋白水解加工形成Core蛋白氨基末端。隨后Core蛋白羧基末端的信號序列將其靶向運輸至內質網膜。宿主酶在內質網腔中啟動雙重加工，信號肽酶從Erns上將蛋白切割下來，釋放出的Core蛋白屬于高度堿性并被推測其與RNA具有結合性[9]。目前研究表明，Core蛋白的抗原表位不僅可以被B細胞識別，也可以被CD4T細胞識別[10]；BVDV Core基因重組腺病毒免疫小鼠后，產生的抗體與BVDV-1和BVDV-2均能產生特異性免疫反應，證明Core蛋白具有很好的免疫原性[11]。因此，為進一步開展Core蛋白的檢測和生物學功能研究工作，本實驗利用原核表達系統得到了Core蛋白，純化后制備了兔抗Core蛋白多克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 載體及菌株

Pet30a質粒載體、BVDV NABL標準毒株、TOP10克隆菌株均來源于蘭州畜牧與獸藥研究所中獸醫實驗室。

1.2 主要試劑及酶

限制性內切酶購自TaKaRa公司；DNA聚合酶購自Zoonbio公司；Tyrptone、Yeast Extract購自OXOID公司；Agarose購自上海基因公司；DNA膠純化試劑盒、質粒小提試劑盒購自AXYGEN公司；弗氏佐劑、Acr、Bis和Tris購自Sigma公司；羊抗兔-HRP購自上海生工生物科技有限公司；SDS購自Amresco公司；TEMED購自BIO-RAD公司；其他試劑均為國產分析純或化學純。

1.3 主要試驗儀器設備及耗材

Allegra 21R 臺式高速冷凍離心機購自美國BECKMAN公司；臺式高速離心機購自德國SORVAL公司；Biologic LP層析系統、Mini Protean Ⅱ垂直平板電泳系統、Gel Doc2000成像系統、水平電泳系統購自美國BIO-RAD公司；PTC-200基因擴增儀購自美國MJ Research公司；320-SpH計購自美國Mettler Toledo公司；AR5120電子天平購自美國AHOM S公司；MultiTemp Ⅲ恒溫水浴鍋、Hofer ΜV-25紫外透射儀購自美國Amersham Pharmacia公司；酶標儀、洗板儀購自Thermo公司；NANODROP2000購自Thermo公司；0.22 μm無菌濾器和透析袋購自Millipore公司。

1.4 Core相應基因片段的擴增

按照RNA提取試劑盒說明書提取BVDV NADL標準毒株感染的牛腎細胞上清中的病毒RNA，用反轉錄酶進行反轉錄，然后PCR擴增BVDV Core基因。參考設計Core蛋白對應基因序列(GenBank登錄號AJ133738.1)的上游引物: F：5′-CCGCATATGTCAGACACGAAAGAAGAGGGAGC-3′；下游引物R：5′-GCCCTCGAGTCCCATTGTAACTTGAA-3′，擴增產物大小約為324 bp，斜體部分為5′端添加的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點，酶切位點前為保護性堿基。

1.5 Core重組表達載體的構建

用Pet30a載體連接回收產物后轉至TOP 10感受態細胞，并置于37 ℃水浴鍋中酶切，2 h后將酶切后的pet 30a載體片段進行核酸電泳，并利用DNA膠回收試劑盒對產物進行回收和純化；利用XhoⅠ和NdeⅠ兩種酶按照上述方法對Core片段進行酶切作用后，膠回收備用將純化的Core酶切產物用T4連接酶于4 ℃連接，12 h后將所得產物轉至感受態細胞，并將感受態細胞置于搖床中不含抗生素的LB培養基復蘇培養45 min；用涂布棒將復蘇后的100 μL菌液均勻涂抹在含有卡那霉素的LB平板上，置于溫度為37 ℃條件下培養，12～16 h后選取單菌落并移至含有卡那霉素的LB液體培養基中，并將培養基置于搖床中，于37 ℃、220 r·min-1條件下培養4～6 h至菌液渾濁。將培養好的菌液送至寶生物工程(大連)有限公司進行測序，并將鑒定正確的陽性質粒命名為Pet30a-Core菌液于-80 ℃凍存。

1.6 Pet30a-Core的誘導表達

將重組載體轉化至大腸埃希菌TOP10中，37 ℃ 220 r·min-1振搖至菌體D600為0.6～0.8；加入IPTG至終濃度為0.5 mmol·L-1，37 ℃ 220 r·min-1振搖4 h，誘導融合蛋白表達；取出培養物離心后，收集菌體，加入PBS進行超聲波破碎后，分別取上清液與沉淀液加入上樣緩沖液重懸。進行12% SDS-PAGE檢測分析，考馬斯亮藍染色顯帶。

1.7 重組蛋白Core的純化和透析

將鑒定可以成功表達的含有Pet30a-Core重組質粒的菌液按1∶100的比例于500 mL LB培養基中擴大培養，至菌液D值達到0.6～0.8時，加入IPTG誘導劑，置于37 ℃恒溫搖床中100 r·min-1振蕩誘導24 h，離心收集菌體。

將表達后的菌體進行超聲破碎后，加入細胞裂解液4 ℃ 10 000 r·mim-1離心20 min，收集沉淀。采用融合蛋白的Ni柱親和法純化透析復性，去除蛋白溶液中的咪唑等有害物質，純化的蛋白進行12% SDS-PAGE分析，并用His單抗進行Western blot鑒定，蛋白分裝保存于-80 ℃。

1.8 多克隆抗體的制備

以原核表達的BVDV Core蛋白進行BCA濃度測定后，免疫2只新西蘭白兔(2.0～2.5 kg)，皮下免疫400 μg·次-1，2～3周免疫1次。采血檢測，通過間接ELISA方法確定抗血清針對BVDV Core蛋白的效價，待效價大于1∶50 000進行最終采血制備抗血清。

1.9 兔抗Core蛋白多克隆抗體效價的測定

以純化的重組Core蛋白為包被抗原(包被濃度為5 μg·mL-1)，以免疫前的兔血清作為陰性對照，將純化后的抗體按1∶500～1∶512 000倍比稀釋，以1∶5 000倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG為酶標二抗，37 ℃恒溫箱1 h，以TMB顯色液，進行間接ELISA檢測。即刻在酶標儀上450 nm讀數，將D值大于設定的陰性對照D值的2.1倍的孔對應的稀釋度，判定為兔抗Core蛋白多克隆抗體的效價。

1.10 蛋白質印跡法(Western blot)檢測多克隆抗體的反應性

蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后，將其轉印至PVDF膜，并在室溫下于5%脫脂奶粉中封閉2 h。于4 ℃條件下孵育1∶4 000倍比稀釋的抗Core多抗10 h，并利用TBST洗膜20 min·次-1，3次后加入1∶10 000稀釋的 HRP標記的羊抗兔IgG，于室溫條件下作用2 h，再次進行TBST洗膜操作后使用ECL發光試劑盒進行顯色，并置于X光膠片暗室內曝光。

1.11 間接免疫熒光(IFA)檢測多抗的反應性

將成功感染BVDV的牛腎細胞和健康牛腎細胞固定后，分別將1∶200稀釋的抗Core多抗加入并孵育1 h，將FITC標記的1∶200稀釋度的羊抗兔二抗加入并孵育1 h，封片并觀察熒光。

2 結果與分析

2.1 Core基因的PCR擴增和質粒鑒定

以BVDV NADL標準毒株的RNA為模板，經反轉錄、PCR擴增、1%的核酸電泳后，可分別在324 bp左右出現一個特異性條帶，其分子質量和預期結果一致。重組質粒Pet30a-Core雙酶切后得到的基因大小為306 bp，說明重組質粒構建成功。

M，DNA marker 4500；1，PCR產物；2，Pet30a-Core的NdeⅠ和XhoⅠ酶切鑒定。M， DNA marker 4500; 1， PCR product; 2， Pet30a-Core digested by NdeⅠ and XhoⅠ.圖1 Core蛋白基因的PCR擴增及雙酶切鑒定Fig.1 The PCR product of Core gene and identification of plasmid Pet30a-Core by restriction enzyme digestion

2.2 重組蛋白Core的誘導表達及純化

挑取轉至TOP 10的Pet30a-Core陽性單菌落加入到含有50 μg·mL-1卡那霉素抗性的LB培養基中置于37 ℃、220 r·min-1恒溫搖床中培養，培養至菌液D值在0.6～0.8時，按1∶2 000加入IPTG誘導24 h；將誘導后的菌液高壓破碎后SDS-PAGE電泳檢測表達情況，圖2中的1-4結果顯示Core重組蛋白有表達且不可溶，圖2中的5至7為純化結果。

2.3 Core蛋白多抗效價測定結果

M，蛋白質分子量標準；1，未誘導的Pet30a-Core全細胞；2，誘導IPTG的Pet30a-Core全細胞；3，誘導IPTG后的Pet30a-Core上清；4，誘導IPTG后的Pet30a-Core沉淀；5～7，蛋白洗脫組分。M， Protein marker; 1， Uninduced Pet30a-Core whole cells; 2， Pet30a-Core whole cells induced with IPTG; 3， Pet30a-Core supernatant after inducted with IPTG; 4， Pet30a-Core precipitation after inducted with IPTG; 5-7， Eluted proteins from column.圖2 Core蛋白的表達和可溶性分析Fig.2 The expression of Core protein and solubility analysis

采集免疫后兔子血液，收集血清，采用間接ELISA的方法測定所獲得的Core蛋白多抗效價，結果可以看出多抗血清效價高于1∶512 000(圖3)。

2.4 Core兔源多抗的鑒定

于BVDV NADL株感染牛腎細胞后28 h，利用Western blot對收集到的細胞進行電泳，或將細胞固定進行間接免疫熒光檢測，進而測定Core蛋白在細胞中的表達。將1∶1 000稀釋的兔源Core多抗作為一抗，再將HRP標記羊抗兔IgG 1∶10 000稀釋后作為二抗。Western blot電泳顯示，Core蛋白在BVDV感染的細胞中為陽性，而在未感染BVDV的牛腎細胞中為陰性(圖4)。間接免疫熒光結果顯示：BVDV感染能利用多克隆抗體檢測到(圖5)。結果表明，本研究制備的Core兔源多抗可通過Western blot和IFA檢測到BVDV Core蛋白。

圖3 Core蛋白多克隆抗體效價Fig.3 Core titer of polyclonal antibodies

1～2，感染牛病毒性腹瀉病毒NADL株后的細胞上清；3，健康牛腎細胞上清。1-2， Cell supernatant after infected with BVDV NADL strain; 3， Healthy MDBK cell supernatant MDBK.圖4 Core蛋白多克隆抗體的Western blot鑒定Fig.4 Western blot identification of Core polyclonal antibodies

1，Core蛋白多克隆抗體試驗組；2，陰性對照組。1， Anti-Core polyclonal antibody group; 2， Negative control group.圖5 Core蛋白多克隆抗體的IFA鑒定Fig.5 IFA identification of Core polyclonal antibodies

3 討論

Core蛋白是黃病毒科病毒的重要結構蛋白之一，其N-端由Npro水解產生，C-端由宿主細胞的信號肽酶切形成[12]。在與BVDV同科的豬瘟病毒(CSFV)、丙型肝炎病毒(HCV)等病毒的研究中發現，Core蛋白對病毒的感染和增殖具有關鍵作用，其能抑制宿主細胞信號的表達，從而抑制宿主細胞代謝、增強病毒本身的侵入和增殖能力[13]。例如，CSFV的復制增殖過程中，血紅蛋白β亞基(HB)能夠起到抑制作用，它可以和視黃酸(維甲酸)誘導基因蛋白Ⅰ相互作用激活 IFN-β的表達，但是HB的表達又受到CSFV Core蛋白的抑制[14]。許多研究表明HCV的Core 蛋白可以被多種宿主蛋白結合，Core蛋白可以與T淋巴細胞表面的球狀C1q受體結合，抑制相關白介素基因的轉錄，從而抑制淋巴細胞的增殖[15]；和波型蛋白結合，能調節細胞的信號轉導、轉化、傳遞過程以及病毒和細胞基因的表達、凋亡及脂質代謝等[16-17]。目前，有關BVDV Core蛋白功能方面的研究很少，宮曉煒[18]首次提出了BVDV core蛋白與PIAS4結合有利于病毒復制和增殖，但引起這一現象的具體機制還需要深入的研究。因此，為了進一步闡明BVDV Core蛋白在病毒持續性感染和抑制機體免疫應答機理中的功能作用，需要建立Core的檢測工具。

本研究選擇大腸埃希菌表達系統，因該系統操作簡單、表達量高和低成本等優點，常用來表達各種蛋白[19]；選用Pet30a原核表達載體，其帶有融合序列較短的His標簽，能提高融合蛋白的表達量，便于后續蛋白純度檢測。本研究成功擴增出Core基因片段，構建了原核表達重組載體Pet30a-Core，該載體能大量表達融合蛋白Core蛋白，且蛋白以包涵體的形式存在，可能與其快速表達、體外缺少相關酶修飾等有關；由于Pet30a載體在Core蛋白基因的C端引入His標簽，利用陽離子(鎳離子)原理對Core蛋白進行純化，獲得了高純度的目的蛋白。將蛋白免疫兔子后采集血清，使用間接ELISA的方法測定多抗效價高于1∶512 000，也證實Pet30a重組載體表達的蛋白具有較好的免疫原性[20]。Western blot結果顯示，多克隆抗體仍能很好的識別BVDV感染牛腎細胞后表達的Core蛋白。IFA檢測結果顯示，抗體能識別Core蛋白的天然構象表位，說明具有類似天然構象結構。

本研究利用大腸埃希菌原核表達系統成功表達了BVDV Core蛋白，并進行了純化和透析，得到大量高純度Core蛋白，且制備了針對Core蛋白的多克隆抗體。通過Western-blot和IFA檢測細胞中感染的病毒粒子和表達的病毒蛋白，證明制備的兔抗Core多克隆抗體具有很強的親和力，為下一步研究該蛋白的功能提供了良好的生物材料。