基于混合培養和PCR-變性梯度凝膠電泳的復合凈水功能菌群構建

王 新，湯江武，吳逸飛，姚曉紅，孫 宏，沈 琦，李園成

(浙江省農業科學院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

在現有的水體修復技術中，生物修復具有環境友好、生態節能的優點，是一種備受重視、迅速發展的水環境治理技術。其中，微生物在污染物的轉化和去除過程中起著核心作用。近年來，基于微生物的污染水體修復技術作為一種公認的高效、低成本的生物修復技術手段，得到了廣泛的認可和成功的應用[1-3]。向污染水體中直接投加功能微生物或能促進原位功能微生物生長的營養物質是當前微生物原位修復過程中通用的方法。已有的研究中，用于水體生物修復的菌劑多為單一菌，一些復合凈水功能菌劑也多為不同菌種的簡單組合、復配，難以適應復雜多變的污染水環境，在水體中的定殖能力和生態活性低，且面臨在原位流動水體中容易散失等問題[4-6]，不適用于原位水體強化修復。解決該問題的核心在于持續穩定地增加適用于水體污染降解和轉化的、執行不同功能的微生物，以強化水體原位生態系統的物質轉化循環過程。因而，開發易定殖、高活性的復合凈水功能菌劑，是當前該領域的重要基礎性問題[7-8]。關于復合菌劑的構建，現有研究通常采用平板劃線法檢測菌株之間是否存在拮抗，然后以此為基礎進行復配和性能檢驗[9-10]。此類方法的局限之處在于，復合菌劑的構建效率較低，且難以反映不同細菌在共同生長條件下的競爭狀況，導致實際應用效果不穩定。

從前期研究獲得的凈水功能菌出發，以混合培養后的菌群動態變化為依據，探索分子監測條件下的復合菌群構建方法，旨在為復合凈水功能菌群的構建和高效應用，以及污染水體微生物強化修復技術的深化提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

用于構建凈水復合功能菌群的菌株系前期從環境中分離獲得的，分別具有氨氧化、反硝化、化學需氧量(COD)降解等功能，具體編號和相關信息詳見表1。菌株活化、準備均采用LB培養基。經過平板劃線法培養檢測，這些菌株兩兩之間均不存在拮抗作用。

1.2 不同凈水功能菌株的混合培養特性

用LB液體培養基對11株菌株進行培養，每2 h取樣一次，測定D600，確定各菌株的生長曲線。將處于穩定生長期的各菌株培養物，參照D600值最小的菌株培養物的D600值，用新鮮的LB培養基進行稀釋，然后各取0.1 mL菌液進行混合，作為起始混合菌液。分別取20、50 μL接入各2個裝有50 mL LB培養基的三角瓶中，在28 ℃、160 r·min-1的條件下進行混合培養，分別在12、24、48 h取樣。對樣品提取基因組DNA并進行PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析，確定所有菌株在共培養條件下的生長特性。

1.3 不同凈水功能菌株組合的混合培養特性

通過1.2節實驗，初步確定菌株S1(AOZ1)、S3(W14)、S6(BSK9)和S7(BSK3)在所有菌株混合共培養條件下可以良好生長。以這4株菌為主體，分別與其他菌株進行組合(表2)。考慮到菌株S2(ADH1)和S4(GC5)具有反硝化功能，在組合中作為重要待測菌株。參照1.2節方法，每菌株懸液加入0.1 mL，混合菌液的接種量統一為10 μL，進行混合培養，在0和24 h取樣，分析菌群結構，篩選適合的復合菌群組合。

表1 用于構建復合功能菌群的凈水功能菌株

Table1Water purifying functional strains used for compound bacteria construction

編號No.菌株Strain菌株種類Species功能FunctionS1AOZ1Pseudomonas putida氨氧化AmmoxidationS2ADH1Pseudomonas stutzeri反硝化DenitrificationS3W14Bacillus cereus氨氧化AmmoxidationS4GC5Pseudomonsa sp.反硝化DenitrificationS5BJ-1Bacillus subtilisCOD降解 COD degradationS6BSK9Bacillus pumilusCOD降解 COD degradationS7BSK3Bacillus polymyxa抑菌除臭Antibacteria and deodorizationS8ZZC-3Rhodospirillum sp.氨氧化AmmoxidationS9ZZC-4Achromobacter denitrificans反硝化DenitrificationS10ZZC-14Rhodospirillum sp.氨氧化AmmoxidationS11ZH-1Rhodospirillum centenum氨氧化Ammoxidation

表2 凈水功能菌組合

Table2Settings of compounder water purifying functional bacteria

編號No.菌株組成StrainsG1S1, S11G2S1, S3, S6, S7G3S1, S2, S3, S4, S5, S8, S9, S10, S11G4S1, S2, S4, S5, S6, S8, S9, S10, S11G5S2, S3, S4, S5, S7, S8, S9, S10, S11G6S1, S2, S3, S4, S5, S6G7S1, S2, S3, S4, S6, S7G8S1, S2, S3, S6, S9G9S1, S6, S8, S9

1.4 復合凈水菌劑凈水效果實驗

根據凈水功能菌群組合的篩選結果，確定以S1(AOZ1)、S3(W14)、S6(BSK9)和S7(BSK3)等4株菌為核心，復配復合菌劑，經培養后用于河道水體的凈水效果實驗。實驗分組及處理方式如表3所示。實驗用河道水樣采自杭州市城郊某河道，水體氨氮(NN)含量為4.5 mg·L-1，COD為32 mg·L-1。采集的水樣分裝1 L于4 L的三角瓶中，每個菌劑組合設置一個平行樣。將培養后的菌株離心沉淀，棄去培養基，用無菌蒸餾水重懸，所有菌株經無菌水稀釋至相同D600值后備用。按照0.5%體積分數加入菌液，單菌直接加入，混菌中各單菌的比例相同。加入5 mL復合菌劑或單菌后，在搖床中以120 r·min-1、30 ℃的條件培養，分別在0、1、2、3、4 d取樣，分析水樣中COD、氨氮、總氮(TN)的變化，其中，0 d為加入菌懸液后取得的樣品。

表3 復合凈水菌劑凈水效果實驗菌株組成

Table3Strains used in the water purification test

編號No.菌株組成StrainsT1S1T2S3T3S6T4S7T5S2, S4T6S1, S2, S4T7S2, S4, S6T8S2, S3, S4T9S2, S4, S7T10S1, S3, S6, S7T11S1, S2, S4, S6T12S2, S3, S4, S7

1.5 混合培養液細菌群落結構的PCR-DGGE分析

1.5.1 DNA提取

各菌株由斜面中接出，在LB液體培養基中培養過夜，取1 mL菌液離心，收集菌泥。取混合培養的培養物0.5 mL，離心，收集菌泥。采用Bioready bacterial gnomic DNA extraction kit提取樣品中的基因組DNA，獲得的DNA經電泳檢測后在-20 ℃保存備用。

1.5.2 PCR-DGGE分析

以提取的樣品基因組DNA為模板，PCR擴增16S rDNA V3區片段，引物為連有“GC-夾子”(5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G-3′)的Eubac341f(5′-TAC GGG AGG CAG CAG-3′)和Eubac517r(5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)[11-12]，參考文獻[13-14]中描述的方法，采用Touchdown PCR程序進行擴增。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用Bio-Rad公司D-code System進行DGGE分析。聚丙烯酰胺凝膠質量分數為8%，變性梯度40%～60%。在60 ℃、50 V條件下電泳1.5 h，然后升電壓至150 V，繼續電泳6 h。聚丙烯酰胺凝膠在EB染液中染色25 min，用TANNON-2500凝膠成像系統采集圖像。

1.6 分析方法與數據統計

水樣中COD含量采用重鉻酸鉀比色法測定，TN含量采用耶拿MULTIN/C 3100型總有機碳/總氮分析儀測定，NN含量參照HJ 536—2009中的方法測定。各項水質指標在測定時均采用3個平行樣品。

采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析，對有顯著差異的處理，采用Tukey法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 凈水菌株及其共同混合培養物的DGGE分析

提取11株凈水菌株及所有菌株混合培養物的基因組DNA，并擴增16S rDNA V3區產物進行DGGE分析。如圖1所示，1～11號泳道分別為單菌S1～S11，12號泳道為所有菌株的初始混合物，13～14、15～16、17～18號泳道分別為菌株混合培養12、24、48 h的結果。圖1中共顯示6條條帶，其中，菌株S1(AOZ1)和S6(BSK9)、S2(ADH1)和S4(GC5)、S3(W14)和S7(BSK3)，以及S8(ZZC-3)、S10(ZZC-14)和S11(AH-1)所示條帶均處于相同的位置。但前期實驗表明，這些菌株的菌落形態和16S rDNA基因有明顯的差異。產生這種現象的原因可能與細菌16S rDNA基因存在多拷貝，以及DGGE技術本身存在的一些不足有關。所有菌株的混合物在培養24 h和48 h后的DGGE圖譜中僅顯示2個主要條帶，對照DGGE圖譜中各個菌株的位置，可以初步確定，菌株S1(AOZ1)或S6(BSK9)、S3(W14)或S7(BSK3)在所有菌株共同培養時，單獨或共同成為優勢菌。

2.2 不同凈水功能菌株初篩組合培養物的DGGE分析

以菌株S1(AOZ1)、S3(W14)、S6(BSK9)和S7(BSK3)為主體進行復合菌群的初篩，DGGE圖譜如圖2所示，其中，1～9號泳道對應表2的G1～G9(0 h)，10～18號泳道對應表2的G1～G9(24 h)，M為所有菌16S rDNA基因片段的混合物。初始混合物中所有菌株均在相應的泳道出現對應的條帶，培養24 h后，混合培養物組成里包含有S1(AOZ1)、S3(W14)、S6(BSK9)和S7(BSK3)4株菌的組合，且其均在相應的培養物中成為優勢菌。該結果充分表明，這幾株菌在混合培養過程中具有競爭優勢。除菌株S2(ADH1)和S4(GC5)在一些培養物中仍能生長外，其他菌株的生長均受到明顯的抑制。相對于菌株S1(AOZ1)和S6(BSK9)，S3(W14)和S7(BSK3)同時存在對菌株S2(ADH1)和S4(GC5)的生長抑制能力更強，如圖2泳道5(0 h)和14(24 h)所示。

泳道1～11，菌株S1～S11；泳道12，各菌株初始混合物；泳道13～14，培養12 h的各菌株混合物；泳道15～16，培養24 h的各菌株混合物；泳道17～18，培養48 h的各菌株混合物。Lane 1-11， Strain S1-S11， respectively; Lane 12， Initial compound bacteria; Lane 13-14， compound bacteria after 12 h; Lane 15-16， compound bacteria after 24 h; Lane 17-18， compound bacteria after 48 h.圖1 各凈水功能菌株及其混合培養物的DGGE圖譜Fig.1 DGGE profiles of 16S rDNA gene V3 fragments of different water purifying functional strains and their mixture

泳道1～9的菌株對應表2中的G1～G9 (0 h)，泳道10～18的菌株對應表2中的G1～G9 (24 h)，泳道M為所有基因片段的混合物。Lane 1-9， G1-G9 in Table 2 at 0 h， respectively; Lane 10-18， G1-G9 in Table 2 at 24 h， respectively; Lane M， All the gene fragments in all test strains.圖2 不同凈水功能菌株初篩組合培養物的DGGE圖譜Fig.2 DGGE profiles of 16S rDNA gene V3 fragments of compound bacteria in preliminary screening test

圖3 復合凈水菌劑作用下水體COD、NN、TN的變化Fig.3 Variation of COD， NN and TN under compound bacteria in 4 d

2.3 復合凈水菌劑的凈水效果

對菌株S1(AOZ1)、S3(W14)、S6(BSK9)、S7(BSK3)，以及以其為主體構建的復合菌劑，用河道原位水進行凈水效果實驗。結果(圖3)顯示，4 d之內，相對于不加菌的對照(CK)，COD的最高去除率為T10組合的48.0%，其中，含有菌株S6的組合，COD去除率均超過40.2%，顯著(P<0.05)高于其他菌株組合。NN的最高去除率同樣為組合T10(76.8%)，含有菌株S1的組合，氨氮去除率均超過69.2%，顯著(P<0.05)高于其他菌株組。在4 d內，TN的最高去除率為組合T11，約為42.8%，其他含有菌株S2和S4的組合之間總氮的去除率差異不顯著，但顯著(P<0.05)高于未含有S2和S4的組合。對COD和NN均有較高去除率的T10的TN去除率僅為23.9%。菌株S1和S6分別具有NN降解和COD降解的功能，在組合的情況下，對污染水體中的COD和NN均具有較好的去除效果。實驗所用的河道水體本身含有大量的微生物，這說明以菌株S1和S6為主體構建的復合菌劑可以有效在水體中定殖、生長，并實現凈水功能。

3 討論

水體污染物的降解和轉化主要依賴于微生物的作用[15]，這也是人類利用功能微生物修復污染環境的基礎。通過強化水環境中的功能微生物，進而加快污染降解、轉化進程，實現水體污染物去除和生態修復，是當前的思路。在實踐中，無論是直接投加功能微生物，還是調控水體生態環境，使原位環境中的土著功能微生物增殖、強化，其本質都是提高特定種類的微生物生態功能，以實現其生態效應。顯然，投加的微生物能否在原位環境下定殖和生長，是影響微生物強化修復效果的核心問題。現有的水體微生物強化修復實踐中，光合細菌、芽孢桿菌、乳酸菌等菌劑得到了較多的應用，盡管已經取得了一定的效果，但也存在投加微生物作用不明確、應用效果不穩定等問題[5-8]，這與污染水環境的水質和水體生態的復雜性有關。因此，組合適應能力更強、功能范圍更廣的復合菌，是今后一段時間內的重要基礎性工作之一，這也是本研究的出發點。

菌株之間的組合并不是簡單的復配，還要面臨生長相容、功能耦合、定殖迅速、活性高等一系列考驗。傳統的復合菌群構建，基本上是先對不同菌分別組合，然后通過功能效果進行檢驗和篩選[9，16-18]，或者直接通過長期的馴化，直接獲得復合菌群[9，19]。這種模式不但效率較低，而且實驗室構建完成的菌群在原位環境中應用時也會出現功能不穩定的問題。針對水環境而言，功能菌株在其中的定殖和生態功能的實現，實質上是一個在原位環境中生長和增殖的過程。因此，在復合菌群的構建過程中，確保菌株的生長是一個極其重要的問題。現有的分子生態技術的發展[20-21]，可以有效監測混合培養過程中菌株增殖和菌群的變化情況，與傳統的培養方法相結合，可以有效發掘能夠復配的出發菌株，并通過菌株功能的互補，實現不同功能復合凈水功能菌群的構建。盡管采用這種模式獲得的復合菌群，如以往獲得的大多數復合菌群一樣，可能因為實驗室混合培養和原位環境的差異而在實際應用中達不到預期的功能效果，但在菌群構建這一過程中具有明顯的優勢。基于這種理念，本研究快速、有效地初步從11株功能菌中篩選出在混合培養條件下能生長成為優勢菌的菌株AOZ1、W14、BSK9和BSK3，并通過進一步的凈水實驗，構建出適合水體污染物去除的復合凈水功能菌群，且在模擬凈水實驗中，菌群表現出對河道污水中COD和NN較高的去除率。