撒壩豬MCUR1基因克隆、生物信息學分析及其組織表達量檢測

董新星，李明麗，崔藝佳，蘭國湘，王孝義，嚴達偉

(云南農業大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201)

Baughman等[1]和De Stefani等[2]兩個研究團隊發現線粒體鈣單向轉運體(mitochondrial calcium uniporter，MCU)位于線粒體內膜上，是鈣離子通道的一個主要成分。研究表明：線粒體內鈣離子的穩態在細胞生理學中起著重要作用[3]。而單向轉運復合體的調節因子是決定線粒體鈣穩態的關鍵[4]。近幾年一些線粒體鈣離子單向轉運體的調節分子如MCUR1(mithondrial calcium uniporter regulator 1)、MICU1(mitohondrial calcium uptake 1)等陸續被鑒定出來，其中MCUR1又被稱為CCDC90A，能夠通過與MCU相互作用調節線粒體對鈣的攝取[5-6]。一旦MCUR1表達缺失，MCU將無法維持正常線粒體的鈣離子水平，將會打破線粒體穩態，從而引起疾病的發生。有研究表明，MCUR1基因上調導致線粒體鈣穩態改變可能是引起腫瘤細胞惡性進展的始動因素。該基因可通過抑制肝癌細胞凋亡，加速肝癌細胞增殖，從而促進肝癌細胞的生長[7]。在MCUR1基因上調引起的線粒體鈣穩態重塑中，凋亡相關蛋白p53是促進肝癌細胞生長的重要分子，并且與MCUR1的表達水平呈負相關[8]。當敲降MCUR1基因時可顯著促進慢性粒細胞白血病(慢性髓系白血病，chronic myeloid leukemia，CML)細胞系K562細胞的凋亡[9]。

目前，關于豬MCUR1基因的結構和功能的研究尚不清楚，本課題組前期簡化基因組結果發現：MCUR1與豬的生長性能存在聯系。本研究對撒壩豬MCUR1進行克隆與生物信息學分析，旨在揭示豬MCUR1基因編碼區序列的生物信息學特征。運用實時熒光定量PCR技術檢測該基因在mRNA水平上的表達規律，豐富MCUR1基因的數據庫信息，為今后研究MCUR1基因在撒壩豬生長相關過程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究采集撒壩豬的脾臟、胰臟、背脂、腎臟、肺、大腦、肝臟、心臟、背最長肌和大白豬的背最長肌，于-80 ℃保存。

1.2 主要試劑及儀器

2×TaqPCR Master Mix、DNA Marker、RNA提取試劑(Trizol)、cDNA第一鏈合成試劑盒、實時熒光定量PCR儀、熒光定量試劑SYBR Premix Dimer Eraser。

1.3 引物設計及合成

根據GenBank上公布的豬的MCUR1基因序列(登錄號：XM_003128183.4 )，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，以ACTIN基因(登錄號：NM_001164650.1)作為內參設計擴增引物，引物序列見表1，引物由北京擎科(昆明)生物技術有限公司合成。

1.4 RNA提取與cDNA合成

采用Trizol法分別提取撒壩豬的脾臟、胰臟、背最長肌和背脂等9種組織以及大白豬的背最長肌的RNA，并反轉錄為cDNA，質控合格后保存備用。

1.5 PCR擴增及克隆

以撒壩豬的肝臟組織樣cDNA為模板擴增MCUR1基因的CDS序列。PCR反應體系為25 μL，包含ddH2O 11 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol·L-1)，cDNA模板0.5 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性4 min；然后94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；于72 ℃后延伸8 min，4 ℃終止反應。退火溫度依引物而異。經檢測后的PCR擴增產物送至北京擎科(昆明)生物技術有限公司進行序列測定，測序結果經比對拼接后，獲得撒壩豬MCUR1基因完整CDS序列。該序列已提交到NCBI網站，獲得登錄號為：MN254967。

1.6 生物信息學分析軟件

采用上述得到的CDS序列，經一系列預測分析獲得MCUR1基因的生物學信息。預測項目與軟件如表2所示。

1.7 實時熒光定量PCR檢測

以撒壩豬不同組織cDNA作為模板，以ACTIN基因為內參，實時熒光定量PCR檢測MCUR1基因在不同組織中的表達。取0.2 mL PCR管，配制如下反應體系，每個反轉錄產物配制3管，反應體系為25 μL∶2×qPCR Mix 12.5 μL，7.5 μmol·L-1上下游引物2.0 μL(表1)，cDNA 2.5 μL，RNase-free水 8.0 μL。PCR反應條件為：95 ℃，10 min為模板的預變性階段；95 ℃，15 s，60 ℃，60 s，共40個循環為模板的擴增階段，60 ℃→95 ℃，每15 s緩慢升溫0.3 ℃，建立熔解曲線階段。結果用2-△△Ct法進行計算。

2 結果與分析

2.1 撒壩豬MCUR1基因CDS的擴增及克隆

以撒壩豬肝臟組織cDNA為模板對MCUR1基因進行克隆，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別發現長度約582、599、476 bp的3條電泳帶(圖1)，經拼接后，獲得1 095 bp的CDS區，與預期的目的條帶一致。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 撒壩豬MCUR1蛋白理化特性與疏水性分析

表1 引物序列信息

Table1Primer sequences information

基因Gene引物序列Primer sequence(5′→3′)片段長度Products length/bp退火溫度Tm/℃用途PurposeMCUR1-1F: CTCGCTCCTGCTGTCGGT58259.6普通PCR Normal PCRR:TCCTACTCCCAGAAGAGGTGAAMCUR1-2F: CGCTCCACCTATGCCTCC59962普通PCR Normal PCRR: CTCGGTGTCTATCTTCCTGTCCMCUR1-3F: ATCACGCTTCAGCAGTTA47660普通PCR Normal PCRR: AGGCAAAACAAAAGAATGMCUR1F: CTGTTCCTCGTCCTGCTTGTG32160實時熒光定量PCR Real-time PCRR: TAAGGCGTGGGTGTCAAAGTAGAACTINF: TGGTTCTGGGCTCTGTAAGGC19160實時熒光定量PCR Real-time PCRR: TGATGCCGTGTTCTATTGGGTA

表2 生物信息學分析工具

Table2Bioinformatics analysis tools

預測項目Predict subject軟件Software網址Website開放閱讀框Open reading frameNCBI OFR /蛋白理化性質Physicochemical properties of proteinProtParam https://web.expasy.org/protparam/疏水性分析Hydrophobic analysisProtscale https://web.expasy.org/protscale/信號肽預測Signal peptide predictionSignalP http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/跨膜區分析Transmembrane analysisTMHMM Server v.2.0http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/亞細胞定位Subcellular localizationPsortⅡhttp://www.psort.org/psortb/Coil區分析Coil area analysisCOILS Serverhttps://embnet.vital-it.ch/software/COILS_form.html磷酸化位點Phosphorylation siteNetPhos 3.1 Serverhttp://www.cbs.dtu.dk/services/Net Phos/糖基化位點Glycosylation siteNetNGlyc 1.0http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/二級結構Secondary structureSOPMAhttps://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html三級結構Tertiary structurePhyre2http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=in-dex進化樹The evolutionary treeMEGA6.0/功能結構域Functional structural domainSAMRThttp://smart.embl.de/smart/job_status.pl?jobid=116547588181601533707646MhEAszEcjMCpG Island預測CpG Island predictionCpG Plot http://www.bioon.com.cn/doc/showarticle.asp?newsid=1115

經ORF Finder程序預測顯示，撒壩豬MCUR1蛋白編碼364個氨基酸(圖2)。經ProtParam在線軟件預測顯示：MCUR1蛋白分子式為C1787H2949N533O503S14，相對分子質量40.398 ku，理論等電點(pI)為10.27，半衰期為30 h，不穩定系數55.70，屬于不穩定蛋白，脂肪指數為95.99，平均親水性為-0.213，屬于親水蛋白。

MCUR1蛋白的氨基酸組成如表3所示：其中含量最高的是丙氨酸(Ala)和精氨酸(Arg)，占全部氨基酸的10.2%。

經Protscale程序預測撒壩豬MCUR1蛋白的疏水性，結果如圖3：第74位亮氨酸(Leu)疏水性最強(3.067)，第15位脯氨酸(Pro)親水性最強(-2.411)。

2.2.2 撒壩豬MCUR1蛋白信號肽和跨膜結構分析

運用SignalP軟件對撒壩豬MCUR1蛋白的信號肽進行預測。由圖4可知，S<0.5，表明撒壩豬MCUR1蛋白不存在信號肽。運用TMHMM Server v.2.0對撒壩豬MCUR1蛋白跨膜結構進行分析，預測結果(圖5)表明，MCUR1蛋白不存在跨膜結構。

圖1 撒壩豬MCUR1基因PCR擴增結果Fig.1 Result of the PCR amplicons MCUR1 gene in Saba pigs

圖2 MCUR1基因ORF分析Fig.2 ORF analysis of MCUR1 gene sequence

表3MCUR1蛋白的氨基酸組成

Table3Amino acid composition of MCUR1 protein

氨基酸Amino acids個數Number占比Percentage%氨基酸Amino acids個數Number占比Percentage/%Ala (A)3710.2Arg (R)3710.2Asn (N)82.2Asp (D)113.0Cys (C)51.4Gln (Q)133.6Glu (E)246.6Gly (G)277.4His (H)51.4Ile (I)133.6Leu (L)5013.7Lys (K)226.0Met (M)92.5Phe (F)102.7Pro (P)184.9Ser (S)246.6Thr (T)184.9Trp (W)51.4Tyr (Y)51.4Val (V)236.3

圖3 撒壩豬MCUR1蛋白質疏水性預測結果Fig.3 The hydrophobicity profile of MCUR1 in pigs analyzed by Prot Scale in Saba pig

圖4 撒壩豬MCUR1蛋白信號肽預測Fig.4 Prediction of MCUR1 protein signal peptide in Saba pig

圖5 撒壩豬MCUR1蛋白的跨膜區分析結果Fig.5 Transmembrane analysis of MCUR1 protein in Saba pigs

2.2.3 撒壩豬MCUR1蛋白亞細胞定位

通過在線軟件PsortⅡ分析預測豬MCUR1基因編碼蛋白的亞細胞定位，結果如表4：該蛋白主要分布在細胞質，其次為細胞質膜，在細胞壁和胞外少量分布。因此，可以推斷出撒壩豬MCUR1蛋白主要在細胞質中發揮作用。

2.2.4 撒壩豬MCUR1蛋白卷曲螺旋預測與分析

通過COILS Server軟件預測撒壩豬MCUR1蛋白的卷曲結構的結果如圖6:MCUR1蛋白含有2個典型的卷曲螺旋結構。

2.2.5 撒壩豬MCUR1蛋白糖基化位點、磷酸化位點預測

運用 NetNGlyc 1.0 預測撒壩豬MCUR1蛋白N糖基化位點(圖7)，發現MCUR1蛋白沒有糖基化位點。運用NetPhos 3.1 Server 在線軟件預測MCUR1編碼蛋白磷酸化位點，結果如圖8所示：當潛在磷酸化位點的閾值為0.5時，MCUR1蛋白存在32個潛在的磷酸化位點，其中包含20個絲氨酸(Ser)位點、10個蘇氨酸(Thr)位點、2個酪氨酸(Tyr)位點。在撒壩豬MCUR1蛋白上可能有unsp、PKC、CaM-II、GSK3等15種保守的蛋白激酶結合位點，在102、141處unsp分值最高，為0.991。

2.2.6 撒壩豬MCUR1蛋白二級結構與三級結構預測

采用ExPAsY的SOPMA程序預測撒壩豬MCUR1蛋白的二級結構如圖9所示：MCUR1蛋白α-螺旋區域有212個氨基酸，占58.24%，β-轉角區域有15個氨基酸，占4.12%，無規則卷曲區域有110個氨基酸，占30.22%，延伸鏈區域有27個氨基酸，占7.42%。采用Phyre2對MCUR1蛋白同源建模獲得三級結構模型，撒壩豬的MCUR1蛋白經折疊、彎曲等一系列過程形成如圖10所示的三級結構。

表4 撒壩豬MCUR1蛋白亞細胞定位分值

Table4Location score of MCUR1 protein in Saba pigs

位置Position分值Score細胞質Cytoplasm7.50細胞質膜Cytoplasmic membrane1.15細胞壁Cell wall0.62胞外Extracellular0.73

圖6 撒壩豬MCUR1蛋白卷曲螺旋預測結果Fig.6 Predicting results of MCUR1 protein crimp in Saba pigs

圖7 撒壩豬MCUR1蛋白的N-糖基化位點預測Fig.7 N-glycosylation sites of MCUR1 in Saba pigs

圖8 撒壩豬MCUR1蛋白的磷酸化位點預測Fig.8 The predicted results of MCUR1 encoding protein phosphorylation sites

圖9 撒壩豬MCUR1蛋白的二級結構Fig.9 Secondary structure of pig MCUR1 protein

圖10 撒壩豬MCUR1蛋白三級結構預測Fig.10 Tertiary structure prediction of MCUR1 protein

2.2.7 撒壩豬MCUR1基因同源性比對和系統進化樹構建

使用MegAlign對牛(XM_024983732.1)、雞(XM_418928.6)、狗(XM_418928.6)、山羊(XM_018039134.1)、人(NM_001031713.3)、猴(XM_010376415.1)、鼠(NM_001081059.3)、綿羊(XM_012115877.2)和豬(XM_005665577.3)的MCUR1基因編碼序列進行同源性分析，結果顯示(圖11)，豬MCUR1基因編碼區序列與牛、雞、狗、山羊、人、猴、鼠、綿羊的同源性分別為85.3%、68.0%、83.6%、87.9%、84.4%、80.3%、76.8%、88.2%。

用MEGA6.0軟件對9個物種進行進化樹分析，結果如圖12：撒壩豬與綿羊、山羊、牛的親緣關系較近，與雞的關系較遠。

2.2.8 撒壩豬MCUR1基因CpG Island預測

運用CpG Plot在線軟件預測撒壩豬MCUR1基因的CpG Island，結果(圖13)顯示，撒壩豬的MCUR1在47～430堿基處有一個CpG Island。

2.2.9MCUR1基因組織表達分析

通過實時熒光定量PCR可知：撒壩豬MCUR1基因在不同組織中的表達量不同(圖14)，其中在肝臟中的表達量最多，在肺臟中的表達量最少。在大白豬的背最長肌中MCUR1的表達量高于撒壩豬的背最長肌(P<0.01)(圖15)。

3 討論

線粒體是細胞內主要的鈣儲存場所之一[10-11]。通過線粒體內膜的鈣離子流對細胞的生物能、胞質內鈣離子的信號轉導以及細胞凋亡途徑的激活都具有調控作用[12-20]。近年來，鈣離子通道及相關蛋白成為研究熱點，其中MCU、MCUR1和MICU1成為研究的主要對象。MCUR1主要與MICU1、MICU2、MCU形成復合體調節線粒體Ca2+轉運。研究證實，MCUR1的缺失會導致線粒體Ca2+濃度嚴重降低，過表達MCUR1會顯著促進線粒體Ca2+內流，提高線粒體對胞質Ca2+的緩沖能力[21]。MCUR1在維持正常細胞能量代謝中起重要作用，MCUR1的缺失會抑制細胞內氧化磷酸化，使細胞能量產生不足，而引起細胞的自噬[21]。有報道顯示，MCUR1在肝癌細胞中的表達水平增加，進而增強線粒體Ca2+的攝取，抑制線粒體凋亡，從而促進肝癌細胞的增殖和存活[22]。原發性肝癌組織中，線粒體鈣離子單向轉運調節分子MCUR1基因表達異常增高，高表達MCUR1的肝癌細胞其靜息水平的線粒體鈣離子濃度明顯上升，而過表達MCUR1不僅能夠激活線粒體鈣攝入，還能顯著促進細胞生長[7]。在多發骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者體內，MCUR1基因表達上調，并通過抑制p53通路促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。在分子機制方面，沉默MCUR1基因后，p53表達升高，p53下游凋亡關鍵分子BCL2(B-cell lymphoma-2)降低，提示MCUR1促進MM細胞增殖有可能是通過抑制p53的表達實現的。多發性骨髓瘤的病因與發病機制至今雖尚未闡明，但是MCUR1基因有望成為多發性骨髓瘤診斷和治療的新靶點[23]。

圖11 撒壩豬與9個物種MCUR1基因編碼區同源性分析Fig.11 Homology analysis of MCUR1 gene CDS region between Saba pig and 9 kinds of species

圖12 基于9個物種MCUR1序列構建的系統樹Fig.12 System tree based on the sequence of MCUR1 of 9 species

圖13 撒壩豬MCUR1基因CpG Island預測Fig.13 Prediction of MCUR1 gene CpG Island in Saba pigs

圖14 MCUR1基因在撒壩豬不同組織中的表達量Fig.14 The expression of MCUR1 gene in different tissues of Saba pig

**表示差異極顯著(P<0.01)。** indicated the significant difference (P<0.01).圖15 MCUR1基因在撒壩豬和大白豬背最長肌中的表達量Fig.15 The expression of MCUR1 gene in Saba pig and Yorkshire

通過生物信息學分析顯示：MCUR1蛋白屬于親水蛋白，沒有信號肽，說明其不屬于分泌蛋白；不存在跨膜結構，暗示該蛋白不是作為膜受體來發揮作用。亞細胞定位顯示，MCUR1蛋白主要定位于細胞質，說明該蛋白主要在細胞質中發揮生物學功能。二級結構預測發現，MCUR1蛋白是以α螺旋為主的混合型結構蛋白，且結構較簡單。在進化關系上，同源性分析和系統進化樹分析都顯示，豬MCUR1基因與山羊、綿羊和牛的親緣關系是最近的。

細胞的生命活動中，線粒體Ca2+穩態至關重要。MCUR1作為線粒體Ca2+的調節者，在細胞正常生命活動及各種疾病中發揮重要作用。目前大部分關于MCUR1基因的研究主要集中在調控線粒體Ca2+的攝取來影響細胞能量代謝與肝癌等疾病發生的相關過程中，在豬體內的相關研究較少。本實驗通過實時熒光定量PCR技術檢測MCUR1基因在撒壩豬各個組織中的表達量發現：MCUR1在肝臟中的表達量最高，在肺臟中的表達量最低，推測豬體內的MCUR1基因主要在肝臟中發揮其生物學功能。檢測該基因在大白豬和撒壩豬背最長肌中的表達量發現，MCUR1基因在大白豬背最長肌中的表達量高于撒壩豬的背最長肌中的表達量(P<0.01)，大白豬相對于撒壩豬，其生長速度較快，這與本課題組通過簡化基因組得到的MCUR1基因定位于生長性狀相關功能上的信息一致。但是由于已有的研究結果有限，關于MCUR1基因在生長性狀過程中發揮的具體作用仍不清晰，需要進行大量的后續試驗來進行闡明。