肺炎支原體肺炎誘導(dǎo)痰中肺炎支原體核酸檢測(cè)研究

謝紅波 王春鳳 陳水文 王世俊 劉純義

深圳市寶安區(qū)婦幼保健院兒科，廣東深圳 518100

肺炎支原體肺炎（MPP）是由肺炎支原體引起的常見呼吸道疾病[1]。MPP 的主要治療方法為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療，但肺炎支原體耐藥株的出現(xiàn)導(dǎo)致了重癥和難治性肺炎支原體肺炎（RMPP）的增加，嚴(yán)重危害了患兒及其家人的健康和生活[2]。MPP 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為培養(yǎng)法，具體為對(duì)咽拭子、咽喉或氣管吸出物、胸腔穿刺液或肺泡灌洗液等送檢MP 培養(yǎng)和分離。MP 培養(yǎng)條件苛刻，生長(zhǎng)緩慢，因而缺乏早期診斷價(jià)值[3]。采集疑似MPP 患兒誘導(dǎo)痰，并進(jìn)行誘導(dǎo)痰MP 核酸（MP-DNA）檢測(cè)，有助于迅速確診MPP[4]，本研究對(duì)疑似MPP 患者誘導(dǎo)痰中（MP-DNA）進(jìn)行檢測(cè)，考察MP-DNA 分布特性，并與金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年12 月～2017 年11 月在深圳市寶安區(qū)婦幼保健院進(jìn)行診斷的疑似MPP 患兒480例。其中男231 例，女249 例；0 ～3 歲患兒72 例，4 ～7 歲患兒248 例，8 ～12 歲患兒160 例；就診月份1 ～3 月108 例，4 ～6 月94 例，7 ～9 月119 例，10 ～12 月159 例。入選標(biāo)準(zhǔn)：有呼吸道癥狀伴或不伴發(fā)熱，疑似MPP 患兒。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往患支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、腎臟或肝臟疾病、反復(fù)呼吸道感染、有重癥肺炎病史仍未痊愈先天性或繼發(fā)性免疫抑制或缺陷、心血管疾病及結(jié)締組織疾病患兒。

將患兒根據(jù)性別分為男性組，女性組，兩組患兒的年齡及就診月份差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；將患兒根據(jù)年齡分為0 ～3 歲組、4 ～7 歲組和8 ～12 歲組，三組患兒的性別及就診月份差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；將患兒根據(jù)就診月份分為1 ～3 月 組，4 ～6 月 組，7 ～9 月 組，10 ～12月組，四組患兒的性別及年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

本研究經(jīng)深圳市寶安區(qū)婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意，患兒家屬簽署參與研究知情同意書。

1.2 研究方法

誘導(dǎo)痰采集：患兒充分漱口后，以濃度為3%高滲鹽水超聲霧化吸入15min，感覺有痰液隨時(shí)咳出到清潔平皿中，取符合標(biāo)準(zhǔn)的痰液1mL，加入等量的痰液蓄積保護(hù)液，旋渦震蕩3min，使其均勻，并于4℃環(huán)境下2000r/min 離心10min，取上清液，將采集到的痰液樣本置于-70℃冰箱中保存待檢。

肺炎支原體抗體檢測(cè)：采用康華生物技術(shù)有限公司肺炎支原體IgM 抗體檢測(cè)試劑盒（膠體金法）檢測(cè)IgM 抗體。結(jié)果＞1 ∶40 為陽(yáng)性。

MP-DNA 定量檢測(cè)：采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的肺炎支原體核酸檢測(cè)試劑盒（PCR 熒光探針法）檢測(cè)患者誘導(dǎo)痰中MP-DNA。結(jié)果＞1×103copies/mL 為陽(yáng)性。

1.3 觀察指標(biāo)

分析不同年齡、不同性別、不同月份MPP 患兒誘導(dǎo)痰中MP-DNA 檢測(cè)陽(yáng)性率，分析MP-DNA 與MP-IgM 結(jié)果的一致性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同性別患兒誘導(dǎo)痰中MP-DNA檢測(cè)陽(yáng)性率

男性患兒MP-DNA 陽(yáng)性率顯著高于女性患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 不同年齡患兒誘導(dǎo)痰中MP-DNA檢測(cè)陽(yáng)性率

三個(gè)年齡段患兒的MP-DNA 陽(yáng)性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），差異具體表現(xiàn)為4 ～7 歲患兒MP-DNA 陽(yáng)性率最高，其次為0 ～3 歲患兒和8 ～12 歲患兒。見表2。

表1 不同性別患兒誘導(dǎo)痰中MP-DNA檢測(cè)陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表2 不同年齡患兒誘導(dǎo)痰中MP-DNA檢測(cè)陽(yáng)性率

2.3 不同月份患兒誘導(dǎo)痰中MP-DNA陽(yáng)性率

不同月份患兒的MP-DNA 陽(yáng)性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），差異具體表現(xiàn)為7 ～9 月份患兒MP-DNA 陽(yáng)性率最高，其次為10 ～12 月份、1 ～3 月份和4 ～6 月份。見表3。

表3 不同月份患兒誘導(dǎo)痰中MP-DNA陽(yáng)性率

2.4 MP-DNA與MP-IgM一致性

57 例MP-DNA 陽(yáng)性患兒中MP-IgM 陽(yáng)性例數(shù)為40 例，423 例MP-DNA 陰 性 患 兒 中MP-IgM 陰性例數(shù)為421 例，MP-DNA 與IP-IgM 的Kappa系數(shù)為0.795，二者高度一致。見表4。

3 討論

肺炎支原體（MP）是兒童呼吸道感染的常見病原體，MPP 是兒童呼吸道感染的常見疾病。嬰幼兒是MPP 發(fā)病的高危群體，但是其具體發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚[5]。一般認(rèn)為，MP 感染成為重癥肺炎的重要原因，MP 會(huì)攻擊并破壞機(jī)體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫防御屏障不完整，在MP 表面電子致密P1 蛋白末端結(jié)構(gòu)的作用下，使其黏附于呼吸道黏膜上皮細(xì)胞上，進(jìn)而破壞支氣管、細(xì)支氣管的黏膜層，破壞上皮纖毛活動(dòng)，誘發(fā)陣發(fā)性咳嗽[6]。有試驗(yàn)在MPP 患兒的血液、腦脊液、皮膚水泡、胸水中分離出了MP，但是目前尚無權(quán)威資料證實(shí)MP 侵入和MPP 發(fā)病之間存在直接因果關(guān)系[7]。馮真英等[8]認(rèn)為細(xì)胞免疫與體液免疫在MPP 的發(fā)病過程中擔(dān)任了非常重要的角色，其作用發(fā)揮方式包括激活B 細(xì)胞和T細(xì)胞，激活NK 細(xì)胞、細(xì)胞毒性T 細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞的溶細(xì)胞活力，激活免疫活性細(xì)胞并使其產(chǎn)生細(xì)胞白介素（如IL-2、IL-4、IL-6 等）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，在炎性細(xì)胞因子的浸潤(rùn)作用下，肺泡壁會(huì)逐漸增厚，導(dǎo)致組織損傷。有研究結(jié)果顯示，處于急性感染期的MPP 患兒會(huì)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞免疫功能抑制，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞對(duì)MP 的反應(yīng)顯著降低，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等生物抗原的反應(yīng)性下降[9]。綜合上述分析可知，MPP 患兒存在免疫系統(tǒng)平衡遭到破壞情況，T 淋巴細(xì)胞遭到抑制，尤其是CD8+T 細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞被激活，導(dǎo)致體液免疫功能失調(diào)。盡管目前MPP 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但有一點(diǎn)是非常明確的，MPP 是多種因素綜合作用的結(jié)果，單一病因無法解釋肺外所有癥狀，MP 對(duì)呼吸組織的直接侵犯作用不足以誘發(fā)MPP，而宿主免疫反應(yīng)改變?cè)贛PP 發(fā)病過程中顯得更加重要。因此，臨床上普遍以免疫指標(biāo)的變化情況作為MPP 臨床診斷、輕重判定、治療和預(yù)后的重要依據(jù)。

表4 MP-DNA與MP-IgM一致性

MP 在全球范圍內(nèi)存在，一般為散發(fā)性，3 ～6年可發(fā)生地區(qū)性流行，人群密集地區(qū)會(huì)集中發(fā)病；我國(guó)MP 引起的肺炎發(fā)病率高于國(guó)外地區(qū)[10]；在中國(guó)支原體肺炎有季節(jié)性特點(diǎn)，秋冬季發(fā)病率較高[11]；有2% ～5% 的MP 感染患兒發(fā)生肺炎，多有發(fā)熱，伴有頭痛和刺激性咳嗽[12]。MP 感染引起的兒童肺炎大部分為5 ～15 歲的少年兒童，偶然會(huì)在5 歲以下兒童中發(fā)生[13]。23% ～50% 的學(xué)齡前兒童和青少年社區(qū)獲得性肺炎是由MP 感染導(dǎo)致的[14]。本研究結(jié)果顯示，4 ～7 歲組MP-DNA 陽(yáng)性率為15.32%，均高于其他年齡組，隨著年齡的減小陽(yáng)性率而降低；7 ～9 月份MP-DNA 陽(yáng)性率為17.65%，均高于其他月份的陽(yáng)性檢測(cè)率，10 ～12 月份陽(yáng)性率為14.47%，均明顯高于1 ～6 月份，存在季節(jié)性差異，秋冬季發(fā)病率高；同時(shí)，男性患兒MP-DNA陽(yáng)性率為15.58%，高于女性患兒的8.43%，與王福玲[15] 報(bào)道的一致。通過本研究發(fā)現(xiàn)，MP 感染患兒的陽(yáng)性率為11.88%，遠(yuǎn)低于泉州[16]地區(qū)的檢出率，但與北京通州[17]地區(qū)一致，可能與地域、取樣季節(jié)和選擇的檢測(cè)對(duì)象有關(guān)。

感染的肺炎近年發(fā)病率持續(xù)升高，耐藥性不斷增加[18]，探討早期、快速檢測(cè)MP 方法非常重要。在臨床上對(duì)頑固性劇咳、哮喘、持續(xù)發(fā)熱和普通抗菌藥物治療無效的患者，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行MP-DNA 檢查，以免漏診和誤診[19]。文獻(xiàn)報(bào)道采用PCR 技術(shù)檢測(cè)痰液標(biāo)本中的MP，116 例標(biāo)本中66 例標(biāo)本PCR 試驗(yàn)陽(yáng)性，32 例血清MP 抗體陽(yáng)性，PCR 法靈敏度要高于血清學(xué)檢測(cè)[20]。另外文獻(xiàn)報(bào)道核酸檢測(cè)陽(yáng)性為87 例，真陽(yáng)性85 例，靈敏度為85%，特異度96%；而抗體檢測(cè)陽(yáng)性為103 例，真陽(yáng)性為70 例，靈敏度為70%，特異度為69%[21]。本研究顯示MP-DNA檢測(cè)與MP-IgM 及金標(biāo)準(zhǔn)具有高度一致性，血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果不能避免患兒的假陽(yáng)性和假陰性問題，因?yàn)楦腥綧P 肺炎的兒童，臨床治療治愈后體內(nèi)仍存有一定強(qiáng)度的抗體滴度，接受抗體檢測(cè)時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性；而免疫缺陷不產(chǎn)生抗體或免疫力低下的兒童自身抗體滴度低，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性就會(huì)失去臨床治療的機(jī)會(huì)。但任何一種檢測(cè)方法都有其檢測(cè)范圍和局限性，且還和標(biāo)本取材有關(guān)。因此，MPDNA 和抗體聯(lián)合檢測(cè)才可以提高M(jìn)P 檢測(cè)的靈敏度和特異度。