調節膽汁酸代謝及腸道菌群對非酒精性脂肪肝治療效果研究

王 菲 王允野 張 丹 趙曉茹 劉 昆

吉林醫藥學院附屬醫院消化內科，吉林吉林 132013

隨著人們飲食結構、生活習慣的改變，非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發病率逐年上升且呈低齡化，已成為我國乃至全球肝硬化的最主要病因之一。NAFLD 多同時伴有其他代謝性疾病，如肥胖、高脂血癥、2 型糖尿病等。目前其發病機制尚未完全明確，可能與胰島素抵抗、氧化應激及脂質過氧化損傷等機制有關[1]，臨床治療上多采用降血脂、保肝、控制飲食、運動等方式，但患者依從性差，難以長期堅持。近些年，多項研究表明NAFLD 與飲食、膽汁酸水平以及腸道菌群有密切關系[2]，通過調節飲食- 膽汁酸- 腸道菌群來治療NAFLD 是目前提出的新的治療途徑，其效果如何目前缺乏實驗研究，本研究應用抗生素、高脂飲食制造非酒精性脂肪肝病模型，并隨機分組給予益生菌、調節膽汁酸治療，觀察比較其療效，為NAFLD 治療方案提供進一步實驗理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

2017 年9 月～2018 年4 月選取SPF 級BALB/c小鼠72 只，雌雄各半，由吉林醫藥學院動物實驗中心提供，體重（18±2）g。頭孢曲松鈉（湖南科倫制藥有限公司，H20065642）1.0g/ 支，配成按100mg/kg 給藥。高脂飼料：82.5% 普通飼料，2% 膽固醇，10%豬油，5% 蛋黃粉、0.5% 三號膽鹽組成[3]。益生菌選用枯草桿菌二聯活菌（北京韓美公司，S20030087）。熊去氧膽酸（德國 Dr.Falk 公司，H20181059），配成10μmol/L 溶液，胃管灌入。采用全自動血清生化儀（荷蘭SelcetraXL）及南京建成生物科技有限公司試劑盒進行測試。

1.2 方法

1.2.1 實驗第一部分方法 隨機選取小鼠40 只，隨機分為四組。10 只小鼠采用普通飼料喂養，為Ⅰ組；10 只采用高脂飼料喂養，為Ⅱ組；另外選擇10只小鼠給予普通飼料喂養，并給予頭孢曲松鈉每日2 次經口灌入，為Ⅲ組。另10 只小鼠采用高脂飼料喂養，同時應用頭孢曲松鈉每日2 次經口灌入，為Ⅳ組。喂養12 周后，深度麻醉小鼠，摘眼球取血，化驗甘油三酯、膽固醇、丙氨酸氨基轉移酶、谷氨酰氨基轉移酶、脂聯素，收集小鼠糞便應用膽汁酸試劑盒檢測膽汁酸水平，無菌取回盲部糞便進行腸道菌群培養進行比較，處死后稱取全肝濕重并記錄，取肝組織制成10% 肝勻漿，應用勻漿器勻漿，測定肝勻漿組織血脂成分。

1.2.2 實驗第二部分方法 根據Ⅳ組方式喂養小鼠32 只12 周后均停用抗生素，給予普通飲食、無菌水，將其隨機平均分為四組，每組8 只，一組為對照組，即A 組；8 只給予熊去氧膽酸，為B 組；另8只給予枯草桿菌二聯活菌經口灌入，為C 組；其余8 只同時給予熊去氧膽酸及枯草桿菌二聯活菌，為D 組。ABCD 四組小鼠均飼養12 周后深度麻醉小鼠，再次化驗上述指標。

1.2.3 標本采集及處理 小鼠血清生化指標的測定：深度麻醉小鼠，摘眼球取血，將血置干燥管中，3000r/min 22℃離心10min，取上層血清，應用全自動生化檢測儀檢測血清中TG、TC、ALT 和AST。

1.2.4 肝勻漿血脂成分測定 測定肝勻漿組織血脂成分，制備10% 肝勻漿：取小鼠肝臟0.5g，用眼科剪在冰上盡快剪碎并倒入玻璃勻漿器中，加入4.5mL 預冷的生理鹽水，將勻漿器下端插入冰水中充分研磨6 ～8min，使肝組織勻漿化。將制備好的10% 勻漿3500r/min 4℃離心10min，取上清液按同樣條件再離心10min，取上清液備用。應用全自動生化檢測儀檢測上清液TG 和TC 含量。

1.2.5 腸道菌群定量檢測 處死小鼠后無菌條件下取其盲腸內容物稱重，10 倍稀釋，進行平板計數，以下幾種培養基進行活菌計數：乳酸桿菌選擇性培養基（LBS）；雙歧桿菌選擇性培養基（BS）；腸球菌選擇性培養基（EC）；腸桿菌選擇性培養基（EMB）。EC、EMB 平板均置于37℃有需氧培養24h 后計數；BS、LBS 平板置于37 ℃厭氧條件下培養48h 后計數。

1.2.6 糞便膽汁酸水平測定 收集小鼠糞便應用膽汁酸試劑盒檢測膽汁酸水平（按說明書操作）。

表1 各組小鼠生化及糞便膽汁酸水平比較

表1 各組小鼠生化及糞便膽汁酸水平比較

注：與Ⅰ組比較，aP ＜0.01

組別 n TG（mmol/L） TC（mmol/L） ALT（IU/L） AST（IU/L） TBA（μmol/L） 脂聯素（μg/mL）糞便膽汁酸水平（mmol/g）Ⅰ組 10 3.27±0.46 0.72±0.14 33.48±1.41 51.17±7.63 5.2±1.14 2.56±0.63 20.15±2.48Ⅱ組 10 4.97±1.17a 0.69±0.83 71.9±2.34a 92.66±8.34a 9.2±2.19a 4.02±0.85a 15.68±1.75aⅢ組 10 3.69±0.77 0.70±0.13 93.95±3.01a 101.33±7.94a 5.6±2.24 2.89±0.65 19.36±1.63Ⅳ組 10 5.13±0.65a 0.73±0.16 145.1±2.07a 130.04±15.20a 11.0±3.56a 4.12±0.69a 14.25±1.23a F 12.463 2.406 538.507 235.657 9.211 17.315 23.417 P 0.000 0.083 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 各組小鼠生化及糞便膽汁酸水平

1.3 統計學處理

采用 SPSS20.0 統計軟件對數據進行統計分析，計量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠一般狀態

各組無死亡，Ⅰ組小鼠食欲好，毛發光澤度好，精神狀態良好，Ⅱ組小鼠體重增長明顯，Ⅲ、Ⅳ組小鼠出現精神萎靡不振，毛色粗糙，行動遲緩，伴有腹瀉，Ⅳ組小鼠癥狀更加明顯。

2.2 各組生化指標比較

2.2.1 各組小鼠生化及糞便膽汁酸水平比較 Ⅱ、Ⅳ組TG、TBA、脂聯素較Ⅰ組均明顯升高，糞便膽汁酸水平明顯下降，比較差異有統計學意義（P＜0.01）。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組ALT、AST 水平均較Ⅰ組升高，差異有統計學意義（P＜0.01），其中Ⅳ組升高最明顯。見表1。

2.2.2 各組小鼠生化及糞便膽汁酸比較 C、D 組TG、脂聯素較A 組均有明顯下降，B、D 組TBA 較A 組明顯升高，比較差異有統計學意義（P＜0.01）。B、C、D 組ALT、AST 較A 組均有明顯改善，糞便膽汁酸水平較A 組均升高，比較差異有統計學意義（P＜0.01），D 組相關指標改善最明顯。見表2。

2.3 各組小鼠肝組織勻漿檢測結果分析

Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組TG，Ⅱ、Ⅳ組TC，與Ⅰ組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。B、C、D 組TG 較A 組明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01），D 組TC 較A 組下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組肝組織勻漿血脂成分（mmol/L）

表3 各組肝組織勻漿血脂成分（mmol/L）

注：與Ⅰ組比較，aP ＜0.01，與A 組比較bP ＜0.01，cP ＜0.05

組別 n TG TCⅠ組 10 1.16±0.25 0.55±0.19Ⅱ組 10 3.09±0.18a 1.38±0.86aⅢ組 10 1.48±0.12a 0.51±0.06Ⅳ組 10 3.39±0.31a 1.45±0.37a A組 8 2.69±0.28 0.98±0.24 B組 8 1.44±0.22b 0.68±0.35 C組 8 1.86±0.13b 0.74±0.26 D組 8 1.12±0.28b 0.58±0.17c F 146.735 18.445 P 0.000 0.000

2.4 各組小鼠腸道菌群檢測結果分析

Ⅲ、Ⅳ組雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌水平較Ⅰ組下降，而腸球菌水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。B、C、D 組雙歧桿菌、乳酸桿菌，C、D 腸桿菌較A 組均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01），B、C、D 組腸球菌與A 組比較無明顯變化。見表4。

3 討論

隨著科學技術的發展、全球經濟化的推進，人們的生存環境、飲食結構、生活習慣等發生了巨大變化，過去人們主要死亡原因是傳染病、感染性疾病，而如今慢性非傳染性疾病發病率逐年上升。肥胖、非酒精性脂肪肝、糖尿病、高脂血癥、高尿酸血癥等代謝性疾病躍居疾病譜前列。非酒精性脂肪性肝病是指排除飲酒、藥物、機械等損肝因素導致大量肝細胞發生脂肪變性，從單純脂肪變性逐漸發展到脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化及其并發癥。NAFLD 是多種因素共同作用結果，其發病機制除了飲食、環境、遺傳等因素外，還與胰島素抵抗、氧化應激和脂質過氧化、膽汁酸代謝、自噬、腸道菌群等因素有密切關系[1]。目前治療多采用保肝、飲食控制、增加運動量等治療方法，本文通過其病因發病機制，探討通過調節膽汁酸代謝及腸道菌群，對NAFLD 治療的效果。

表4 各組腸道菌群定量檢測結果比較

人體腸道內有大量微生物，稱為腸道菌群，其數量可達1014，被稱為“人體最大的器官”。腸道菌群不僅數量巨大，種類也非常豐富，是一個復雜的微生態系統，腸道菌群的主要功能包括分解碳水化合物，參與機體維生素的合成，促進各種離子的吸收，產生有機酸維持腸道內環境適合的pH 等。另外腸道菌群通過營養、腸道上皮細胞黏附位點的競爭以及產生抗菌物質等機制發揮屏障功能，抵御外來菌的定殖。通過觀察無菌小鼠及非無菌小鼠相同食物消耗情況，體重變化，以及給無菌小鼠定植正常小鼠盲腸內容物引起即使攝入食物少也會造成脂肪累積、血脂變化等實驗，顯示腸道菌群在能量攝取轉化方面起重要作用[4-5]。腸道的血流經門靜脈系統進入肝臟，可使致病菌和LPS 大量移位損傷肝功能，反之肝臟功能異常，通過膽汁分泌和腸肝循環引起腸道功能紊亂，它們之間的病理生理聯系稱為“腸- 肝軸”。慢性肝炎、肝硬化、原發性肝癌患者降低腸道清除能力，增加外來菌的粘附機會，且影響腸道PH 值，導致細菌過度生長。大量研究表明，腸道菌群在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的發生中起重要作用[6]。Wigg 等[7]實驗研究發現50%NASH 患者存在小腸細菌過度生長。Farhadi 等[8]通過研究發現NASH 的發生發展與腸道通透性之間的關系。

本研究通過高脂飲食及頭孢曲松鈉誘導NAFLD 小鼠模型，觀察Ⅱ、Ⅳ組小鼠，TG、TBA、脂聯素均明顯升高，糞便膽汁酸水平明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01）。實驗組ALT、AST 水平均較對照組升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。肝勻漿血脂成分Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組TG，Ⅱ、Ⅳ組TC，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01），提示高脂飲食及抗生素可引起肝內血脂成分顯著升高，肝臟出現彌漫性脂肪變性，肝功轉氨酶水平升高，引起NASH。比較各組腸道菌群變化，Ⅲ、Ⅳ組雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌下降明顯，腸球菌水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。實驗表明腸道菌群失調可加重肝臟損害。Li 等[9]應用混合益生菌治療ob/ob 小鼠，能夠有效改善肝組織學，降低肝總脂肪酸含量，并能降低ALT 的水平，證實益生菌能夠治療NAFLD。本實驗應用枯草桿菌腸球菌二聯活菌后，小鼠腸道菌群改善，血脂及肝臟相關指標也有所好轉，說明改善腸道菌群能有有效治療NAFLD。目前研究認為，腸道菌群失調引起NAFLD 的機制：（1）增加能量攝入導致肥胖[4]，進而引起一系列代謝性疾病；（2）改變腸道的通透性，產生低度炎癥；（3）腸道微生物有害產物通過“腸－肝軸”，導致肝損害等。此外，還認為腸道微生物有調節飲食膽堿代謝、膽汁酸代謝[10]及增加內源性乙醇來發揮作用。

膽汁酸是膽汁的重要組成成分，是膽固醇的終末降解產物，在脂肪代謝中起重要作用，且能夠調節膽固醇的水平。膽汁酸在肝臟合成后進入膽囊，在膽囊中儲存濃縮5 ～ 10 倍，食物可引起膽囊收縮，驅動膽汁酸的腸肝循環[11]。各種形式膽汁酸在腸道發揮不同的生理功能，在腸道菌群作用下，發生轉化，并按主動運輸或被動運輸機理大約 95% 的膽汁酸被重吸收，只有大約5% 的膽汁酸隨食物殘渣排出，丟失的膽汁酸則通過膽汁酸的合成補充。膽汁酸的代謝多由核受體FXR 和G 蛋白偶聯受體TGR5 介導，這種作用的具體機制目前還不是很清楚，研究表明，膽汁酸除促進脂溶性物質消化外，還是通過直接或間接激活法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，FXR）和G 蛋白偶聯膽汁酸受體5（G protein coupledbile acid receptor 5，TGR5）在 葡 萄糖和脂質代謝中發揮作用[12]。目前認為膽汁酸與高血脂、肥胖、糖尿病等代謝性疾病有著密切關系。基于膽汁酸腸- 肝循環，本實驗通過經胃灌注熊去氧膽酸，調節膽汁酸水平，觀察對NAFLD 小鼠肝臟的影響。觀察發現，熊去氧膽酸可以改善小鼠的肝臟功能及脂肪變性相關指標。Bechmann 等[13]對113 名NAFLD 患者進行研究，發現隨著體內游離脂肪酸水平的升高，CYP7A1 和膽汁酸轉運體鈉離子/ 牛磺膽酸鹽同向轉運器（Na+/taurocholate cotransporter，NTCP）的表達水平提高，提示膽汁酸的合成速率和血漿中的膽汁酸濃度與NAFLD 嚴重程度相關。

腸道菌群對膽汁酸的轉化必不可少，腸道細菌數量增加，刺激FXR 或TGR5 的表達，抑制膽汁酸的合成。不同腸道菌屬，也影響膽汁酸的代謝，腸道中的厚壁菌屬和放線菌屬刺激膽汁酸合成，而擬桿菌屬和變形桿菌屬則抑制膽汁酸合成。膽汁酸是一種抑菌活性物質，能夠抑制細菌生長增殖，可以顯著影響腸道菌群的生長和組成。在膽汁淤積及終末期肝病患者中，腸道中的膽汁酸含量降低，造成細菌過度生長[14]。給予肝硬化大鼠膽汁酸，提高腸道膽汁酸濃度，會抑制腸道細菌過度生長，減少細菌移位的發生[15]。WAHLSTR?M A[16-17]等進行的實驗研究表明，給無菌小鼠，接種人類腸道菌群后，可抑制小鼠膽汁酸的合成。小鼠口服1.25 ～5.00mmol/kg的膽汁酸，改變小鼠膽汁酸水平，其腸道菌群種類比例也發生變化，厚壁菌屬由54% 升高至94% ～98%，而擬桿菌和放線菌比例顯著降低[18-19]。Boulange 等[20]研究發現腸道微生物能減少腸道膽汁酸重吸收，使糞便膽汁酸排泄增加。Degirolamo 等[21]應用混合益生菌喂飼小鼠，結果發現，混合益生菌能夠顯著增加腸道中厚壁菌屬和放線菌屬的數量，降低擬桿菌屬和變形桿菌屬的數量，增加糞便中膽汁酸的排出量，降低腸道FGF 的表達水平，提高CYP7A1 和CYP8B1 的活性，從而增加肝臟膽汁酸的產量。

大量動物實驗和臨床研究表明，在腸道菌群失衡或膽汁酸代謝紊亂的情況下，腸道菌群、膽汁酸代謝和NAFLD 構成相互影響的惡性循環。Devkota等[22] 的研究表明，飲食中的脂肪酸能夠通過改變膽汁酸池中的膽汁酸成分，進而使腸道菌群發生改變。經抗生素處理后腸道菌群減少，腸道膽汁酸重吸收增加，糞便中膽汁酸排泄顯著減少[23]。本實驗給予脂肪肝小鼠益生菌和熊去氧膽酸，調節腸道菌群及膽汁酸水平，觀察表明可有效改善肝臟功能及血脂水平，促進肝細胞修復。

總之，由于非酒精性脂肪肝的發病率增加，對其治療成為目前研究的熱點，有學者[17]提出肝臟-膽汁酸- 腸道微生態軸的概念，通過調節飲食- 膽汁酸- 腸道菌群來治療非酒精性脂肪肝是目前提出的新的治療途徑。本實驗觀察發現通過調節腸道菌群及膽汁酸水平可以有效改善肝臟脂質代謝及炎癥反應，對非酒精脂肪肝新的治療方案提供實驗理論支持。