銀杏黃酮對缺氧復氧心肌H9c2細胞損傷的保護作用及其機制

高 陽，康 凱，王 慧

(哈爾濱醫科大學第一附屬醫院 重癥監護室，黑龍江 哈爾濱 150001)

心肌缺血再灌注損傷是一個復雜的病理生理過程，涉及心肌細胞凋亡、氧化應激、炎癥反應多個環節[1]。心肌缺血時誘發氧化應激反應，脂質過氧化產物及炎性因子釋放增加，破壞心肌細胞正常生理功能，加重心臟組織損傷[2]。銀杏黃酮(ginkgo biloba)系中藥銀杏葉的活性成分，具有抗炎、抗氧化、擴張血管、抑制血小板聚集等藥理作用，此外，銀杏黃酮對缺血再灌注心肌具有保護作用[3-5]。本實驗以H9c2細胞為研究對象，采用缺氧/復氧處理模擬在體心肌缺血再灌注損傷，研究銀杏黃酮對H9c2細胞的保護作用及機制，為其臨床應用提供科學的實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料 銀杏黃酮(批號：8310469，購自深圳市思美泉生物科技有限公司)；H9c2細胞(中科院上海細胞庫)；DMEM培養基(北京索萊寶科技有限公司)；CCK8試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒、丙二醛(malondialedhyde，MDA)活性檢測試劑盒(南京建成生物試劑公司)；Hoechst 染色試劑盒(上海碧云天公司)；FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；Bcl-2及Bax抗體(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 缺氧復氧模型的建立及細胞分組 共分4組，每組5個復孔。①對照組：H9c2細胞培養于含有10%胎牛血清的DMEM培養液中，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養，3～5 d換液1次。②實驗組(缺氧復氧心肌細胞模型)：H9c2細胞置37 ℃培養罐中，緩慢持續通入含有5% CO2+95%N2的混合氣體，至罐內氧氣含量低于1%，造成H9c2細胞的缺氧，密封培養罐4 h后，把原來的培養液吸除，重新更換培養液，立即將H9c2細胞移至37 ℃、5%CO2的培養箱中繼續培養12 h，使細胞復氧。③銀杏黃酮低、高濃度組進行缺氧/復氧操作前0.5 h，在培養基中加入溶于DMSO的銀杏黃酮(1、10 μg/ml)，其余步驟及同實驗組。

1.2.2 CCK 8法測定H9c2細胞增殖 H9c2細胞培養于96孔板內，每孔200 μL，細胞密度為1×105/mL，棄去原有培養液，將已配置含10%CCK8的培養基以換液的形式加入，接種后的96孔板37℃培養箱中培養4h，觀察細胞已貼壁。用480 nm吸光度進行檢測。

1.2.3 各組細胞上清液 LDH 及細胞內SOD、MDA 檢測 收集H9c2細胞上清液，嚴格按照 LDH試劑盒說明書檢測各組細胞上清液LDH活性；另取各組細胞，裂解后按照 SOD、MDA試劑盒的方法進行各樣本吸光度值檢測。

1.2.4 細胞凋亡的形態學觀察 我們采用Hoechst染色法定量觀察細胞凋亡情況，細胞接種于6孔板中，調整細胞密度至3×105/mL，按照試劑盒說明，更換細胞培養液并用PBS沖洗3遍，在150 μL 的Binding Buffer中分別加入Hoechst(5 μL)，室溫避光反應5 min，熒光顯微鏡下觀查并拍照并統計分析凋亡細胞比例。

1.2.5 透射電子顯微鏡觀察H9c2細胞超微結構 H9c2細胞固定于2.5%戊二醛溶液中，4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗2次后四氧化鋨(1%)后固定，梯度脫水包埋，做超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色5 min，透射電子顯微鏡下觀察細胞超微結構改變。

1.2.6 Western Blot檢測Bcl-2及Bax的蛋白表達水平 收集細胞冰上加入400 μL含有蛋白酶抑制劑的裂解液研磨30 min以提取蛋白，10 000 rpm離心10 min后取上清，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后5%的脫脂奶粉4℃封閉2 h，加一抗(稀釋濃度1∶1 000)過夜，室溫下孵育二抗(稀釋濃度1∶2 000 )1 h，ECL化學發光法自顯影并采集圖像。利用樣本目的蛋白的光密度比內參條帶的光密度，比較不同樣本的相對表達率。

2 結果

2.1 銀杏黃酮濃度依賴性的提高H9c2細胞存活率 實驗組H9c2細胞存活率為(31.37±3.51)%，與對照組(98.66±4.50)%比較差異具有統計學意義(P<0.05)。低、高濃度銀杏黃酮處理后，H9c2細胞存活率逐漸提高，分別為(54.80±4.27)%和(68.04±6.85)%，與實驗組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.2 銀杏黃酮對缺氧/復氧H9c2細胞LDH、SOD活性和MDA水平的影響 如表1所示，與對照組相比，實驗組細胞外培養基中LDH的釋放顯著增加(P<0.05)。與實驗組相比，銀杏黃酮能夠顯著降低缺氧/復氧H9c2細胞外上清液中LDH水平(P<0.05)，說明銀杏黃酮能緩解細胞損傷。與對照組比較，實驗組H9c2細胞內SOD水平降低，MDA水平升高(P<0.05)；與實驗組比較，銀杏黃酮組能顯著升高SOD活力，降低MDA水平(P<0.05)，且呈劑量依賴性。

表1銀杏黃酮對缺氧/復氧H9c2細胞LDH、SOD和MDA的影響

組別LDH(U/L)SOD(U/g)MDA(nmol/mg)對照3.16±1.22167.09±4.431.43±1.85實驗26.08±1.35?108.28±5.13?8.24±2.37?銀杏黃酮低濃度17.74±1.53#127.53±4.17#5.75±2.64#銀杏黃酮高濃度8.59±1.55#143.11±3.63#3.79±2.00#

*：與對照組比較，P<0.05；#：與實驗組比較，P<0.05。

2.3 銀杏黃酮對H9c2細胞凋亡的影響 熒光顯微鏡下，對照組未見明顯凋亡細胞，細胞核均為暗藍色低熒光；實驗組細胞核著色不均勻，凋亡細胞呈亮藍色高熒光；銀杏黃酮處理后凋亡細胞數量逐漸減少(見圖1)；各組細胞的調亡情況見表2。

A：對照組；B：實驗組；C：銀杏黃酮低濃度組；D：銀杏黃酮高濃度組。圖1 Hoechst染色觀察H9c2細胞凋亡

表2各組細胞凋亡率

組別細胞凋亡率(%)對照4.57±2.34實驗69.09±5.31 ?銀杏黃酮低濃度45.88±5.53 #銀杏黃酮高濃度23.63±4.27 #

*：與對照組比較，P<0.05； #：與實驗組比較，P<0.05。

2.4 各組細胞超微結構改變 對照組H9c2細胞核形態正常，核膜連續，細胞核染色質分布均勻；實驗組H9c2細胞腫脹，可觀察到空泡樣結構(自噬溶酶體水解其內容物后的產物)線粒體腫脹；低、高濃度銀杏黃酮處理后，H9c2細胞形態逐漸改善，線粒體、溶酶體等細胞器逐漸恢復正常形態(見圖2)。

A：對照組；B：實驗組；C：銀杏黃酮低濃度組；D:銀杏黃酮高濃度組；放大倍數×10000。圖2 電鏡觀察H9c2細胞改變

2.5 銀杏黃酮干預促進Bcl-2蛋白表達并降低Bax蛋白表達 Bcl-2蛋白在實驗組中的表達明顯降低，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)；低、高濃度銀杏黃酮組Bcl-2蛋白表達逐漸升高，與實驗組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；Bax蛋白在實驗組中的表達明顯升高，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)；銀杏黃酮干預可降低Bax蛋白的表達，低、高劑量銀杏黃酮組Bax蛋白的相對表達量與實驗病組相比差異有統計學意義(P<0.05，見圖3，表3)。

A：對照組；B：實驗組；C：銀杏黃酮低濃度組；D:銀杏黃酮高濃度組。圖3 銀杏黃酮對H9c2細胞內Bcl-2及Bax表達的影響

組別Bcl-2Bax對照1.63±0.540.21±0.06實驗0.56±0.35 ?0.89±0.11 ?銀杏黃酮低濃度0.80±0.16 # 0.52±0.10 # 銀杏黃酮高濃度1.22±0.18 #0.30±0.12 #

*：與對照組比較，P<0.05； #：與實驗組比較，P<0.05。

3 討論

多種心血管疾病的損傷機制與心肌細胞的缺氧復氧損傷密切相關[6]。心肌細胞復氧后在黃嘌呤氧化酶的作用下大量活性氧族(ROS) 堆積，導致內皮細胞功能障礙，進一步促進ROS的生成[7-8]。本實驗模擬心肌缺氧再灌注損傷，體外培養H9c2細胞并制備缺氧/復氧損傷模型，以期進一步探討該藥物對H9c2細胞的保護作用。我們的研究結果顯示，缺氧/復氧破壞了H9c2細胞正常生理功能，細胞存活率明顯下降。

臨床上，銀杏黃酮已被用于輔助治療心肌缺血再灌注損傷[9]。研究顯示，銀杏黃酮通過擴張心肌血管改善微循環、恢復缺血病變區血流量，有利于心臟功能復原和改善；此外，銀杏黃酮還可減輕心臟血管損傷和炎癥反應，從而減少缺血缺氧對心臟功能的損傷，對心肌缺血再灌注損傷疾病有較好療效[10]。

關于銀杏黃酮對H9c2細胞缺氧復氧損傷保護作用的研究不多，國內學者徐露通過制備大鼠心臟缺血再灌損傷模型，在體觀察銀杏黃酮對大鼠心肌保護作用，證實銀杏黃酮可改善大鼠心律失常，對抗大鼠心臟缺血再灌損傷并降低Cx43異常表達[11]。

心肌細胞氧化功能破壞產生大量ROS。銀杏黃酮預處理能顯著降低缺氧復氧H9c2細胞外上清液中LDH漏出率，增加缺氧復氧H9c2細胞內SOD的表達，降低細胞內MDA含量，說明銀杏黃酮能夠有效緩解細胞損傷。

Hoechst 染色劑能透過細胞胞膜并嵌入細胞核DNA，使其發出明亮的藍色熒光。凋亡的細胞核濃染，熒光增強，呈致密顆粒和(或)塊狀高熒光。本實驗中，實驗組中亮藍色熒光顯著增加，證實缺氧復氧可誘導H9c2細胞凋亡，銀杏黃酮低劑量組及銀杏黃酮高劑量組中凋亡細胞比例逐漸下降。

心肌缺血再灌注導致的細胞損傷通過細胞凋亡方式最終導致心肌細胞死亡。Bcl-2在氧化應激介導的細胞凋亡反應中起重要作用，具有潛在的抗凋亡作用[12]。Bax表達水平的高低直接反應細胞凋亡程度，Western blot結果顯示，實驗組細胞中Bcl-2蛋白表達明顯降低，Bax蛋白表達明顯增加，提示缺氧復氧誘導了心肌細胞凋亡，銀杏黃酮通過改變Bcl-2、Bax蛋白的表達發揮抗細胞凋亡作用，增強損傷心肌組織對缺血、缺氧的耐受。

綜上所述，銀杏黃酮能夠有效抑制缺氧復氧誘導的H9c2細胞凋亡，因此我們推測，銀杏黃酮在預防和治療心肌缺血再灌注損傷疾病方面具有一定的應用前景。