運動預適應對急性低壓低氧大鼠腦海馬線粒體生物合成的影響

劉 靜，張紅英，薄 海，康偉民

高海拔地區低氧暴露導致神經系統功能障礙，表現為反射活動、學習能力、注意力、記憶力等認知能力下降，是高原環境人體作業能力低下的重要因素之一。探尋低氧損害認知能力的機制及干預措施是高原醫學重要研究課題[1]。腦海馬是負責處理學習與長期記憶的大腦區域，血液供應和線粒體較豐富，其功能依賴于線粒體有氧氧化能力。研究表明，低氧導致腦海馬線粒體呼吸鏈復合體活性及呼吸速率降低[2]，提示線粒體是提高腦海馬低氧耐受能力的關鍵靶位。將健康線粒體含量保持在一定水平是細胞應對應激的重要基礎，這個過程由調控線粒體新生的線粒體生物合成完成[3]。筆者前期在人體試驗中發現，平原運動預適應可明顯上調急進高原后淋巴細胞線粒體自噬，改善線粒體呼吸鏈復合體活性[4]。本研究旨在探討常氧環境中運動預適應是否能改善急性低氧暴露對腦海馬線粒體生物合成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 選取3月齡清潔級Sprague-Dawley大鼠24只，雄性，體重(215.39±18.66)g，由北京華阜康生物股份公司提供，動物許可證號：SCKK(京)2015-0005，常規進食水，人工光照12 h/d，室內溫度(25±1)℃。

1.2 實驗分組 動物適應性喂養5 d后，隨機分為3組：對照組、急性低氧組(acute hypoxia group, AH)和運動預適應+急性低氧組(exercise preconditioning+ acute hypoxia group，EP+AH)，每組8只。EP+AH組大鼠在常氧環境中進行6周動物跑臺訓練，坡度5°, 速度17 m/min，持續60 min，每日上午8:00～9:00訓練一次，5次/周。末次運動訓練后24 h，AH組和EP+AH組大鼠置于低壓低氧艙8 h，艙內壓力0.06 MPa(模擬海拔7000 m氣壓)，氣流量0.10 m3/h，氧含量維持于10%±2%。大鼠出低氧艙后即刻處死，冰面分離雙側腦海馬，一側用于提取線粒體，另一側制備腦海馬組織勻漿，-80 ℃凍存待測。

1.3 腦海馬線粒體膜電位測定 腦海馬線粒體純化參照文獻[5]要求進行。差速離心法提取腦海馬線粒體，考馬斯亮藍法測定樣品蛋白濃度。采用JC-1熒光探針標記法檢測線粒體膜電位，嚴格按照線粒體膜電位檢測試劑盒(碧云天生物技術公司)說明書操作，熒光分光光度計檢測。

1.4 腦海馬線粒體活性氧(ROS)生成速率測定 二氯熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA, Sigma)標記線粒體ROS，熒光分光光度計連續監測熒光強度變化(激發/發射波長設定488 nm/525 nm)，計算熒光強度變化速率。

1.5 腦海馬線粒體ATP合成活力測定 采用熒光素-熒光素酶發光法檢測線粒體ATP合成活力，在工作液中順序加入0.10 mg線粒體和40 μmol/L熒光素酶(Sigma)，繼而加入5 μM ADP啟動反應，記錄發光強度變化曲線。

1.6 腦海馬線粒體DNA(mtDNA)拷貝數測定 嚴格按照DNA提取試劑盒(Biovision)說明書純化細胞總DNA。采用實時熒光定量PCR方法檢測核基因18s rRNA和線粒體基因CytB的含量。引物序列：18s rRNA上游，5′-GGACCTGGAACTGGCAACAT-3′；下游：5′-GCCCTGAACTCTTTTGTGAAG-3′。CytB上游，5′-CGGCTGACTAATCCGATACC-3′；下游，5′-TGGGAGTACATAGCCCATGA-3′。將CytB與18s rRNA含量比值表示為mtDNA相對拷貝數。

1.7 腦海馬相關蛋白表達測定 Western blot法測定各組腦海馬PGC-1α、NRF1和Tfam蛋白表達，β-actin作為內參標記蛋白。SDS-PAGE電泳分離蛋白，對應一抗標記，辣根過氧化物酶標記二抗結合后ECL顯色液顯影，X射線曝光記錄，掃描各條帶灰度值。NC組條帶灰度值定義為100%，AH組和EP+AH組灰度值表示為與NC組比較的相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠腦海馬mtDNA拷貝數、線粒體膜電位、ROS產生速率和ATP合成活力比較 與對照組比較，AH組腦海馬mtDNA拷貝數和線粒體ROS產生速率均升高(P<0.05)，線粒體膜電位和ATP合成活力均降低(P<0.01)，EP+AH組線粒體ATP合成活力降低(P<0.05)。與AH組比較，EP+AH組腦海馬mtDNA拷貝數和線粒體ROS產生速率均降低(P<0.05)，線粒體膜電位和ATP合成活力均升高(P<0.05，表1)。

2.2 各組大鼠腦海馬過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子(NRF1)和Tfam蛋白表達的變化 與NC組比較，AH組腦海馬PGC-1α、NRF1和Tfam蛋白表達均升高(P<0.05)，EP+AH組PGC-1α和NRF1蛋白表達均升高(P<0.05)。與AH組比較，EP+AH組腦海馬PGC-1α、NRF1和Tfam蛋白表達均降低(P<0.05，表2)。

表1 急性低氧和運動預適應對大鼠腦海馬mtDNA拷貝數、線粒體膜電位、ROS產生速率和ATP合成活力的影響

注：與NC組比較，①P<0.05；與NC組比較，②P<0.01； 與AH組比較，③P<0.05

表2 各組大鼠腦海馬線粒體生物合成相關蛋白表達的變化

注：與NC組比較，①P<0.05；與NC組比較，②P<0.01；與AH組比較，③P<0.05

3 討 論

線粒體蛋白是由細胞核DNA和線粒體DNA共同編碼的，mtDNA拷貝數是線粒體數量標志。三羧酸循環產生的質子在經過線粒體呼吸鏈傳遞時形成膜電位，后者通過復合體Ⅴ轉化為ATP，因而膜電位是線粒體健康水平金標準[6]。本研究中，急性低壓低氧暴露導致腦海馬mtDNA拷貝數顯著增加，但同時線粒體膜電位明顯降低。低氧狀態下，線粒體呼吸鏈上傳遞的電子多于末端氧原子，造成活性氧產生增多[7]。mtDNA靠近ROS產生位點，且缺乏組蛋白保護，極易受到攻擊。在衰老肝臟細胞中證明，mtDNA突變導致其編碼的呼吸鏈復合體亞基異常，線粒體膜電位降低，ATP供應減少反饋性誘導線粒體生物合成，受損mtDNA復制增加，進一步促進ROS產生，形成惡性循環[8]。因而，異常線粒體增加是急性低氧損傷的病理機制之一。

PGC-1α是線粒體生物合成關鍵控制因子，通過上調NRF1和Tfam轉錄表達，協同調控細胞核DNA和mtDNA編碼線粒體蛋白的表達，促進線粒體新生[9]。本研究中，急性低壓低氧暴露導致腦海馬PGC-1α及其下游NRF1和Tfam表達量降低，這與mtDNA變化趨勢一致。在腦皮質缺血大鼠模型中證明，AMP/ATP比值降低活化單磷酸腺苷依賴性蛋白激酶(AMPK)，后者可增加PGC-1α轉錄活性[10]。此外，本研究表明ROS可激活絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)，進而磷酸化修飾轉錄激活因子 2(ATF2)，后者結合PGC-1α啟動子促進其表達[11]。本研究中，急性低氧暴露導致線粒體ROS產生速率升高，ATP合成活力降低，這可能啟動了PGC-1α介導的線粒體生物合成。

本研究中，常氧環境運動預適應顯著抑制了急性低壓低氧對線粒體生物合成的上調效應，同時線粒體膜電位和ATP合成活力顯著升高，而ROS產生速率明顯降低。筆者前期在人體實驗中也發現，移居高原3 d淋巴細胞mtDNA拷貝數升高，但mtDNA中氧化修飾堿基含量增加，而移居高原90 d淋巴細胞mtDNA拷貝數低于平原階段，同時mtDNA氧化損傷減少[12]。提示線粒體數量減少但質量提高是低氧習服的標志之一。研究表明，耐力運動訓練可促進腦海馬線粒體空間結構趨向于融合，抗氧化酶水平升高，線粒體自噬增加[13]。Zhang等[14]也報道，運動預適應可提高腦皮質抵抗缺血損傷的能力。我們推測，運動預適應提供了線粒體修復能力和異常線粒體清除能力，單個線粒體健康水平和供能能力提高，足以匹配能量需求，因而無需提高線粒體數量進行代償，這也是一種生物節省化的表現。

綜上所述，運動預適應可抑制急性低壓低氧對線粒體生物合成的上調效應，同時改善線粒體能量代謝能力，抑制氧化應激，提高腦海馬對急性低氧暴露的抵抗力。