lncRNA ANRIL在銀屑病患者病變皮膚組織中的表達及其臨床意義

金 曌， 陳 慧， 程 楊， 蘇 慧， 付 霆

銀屑病是一種常見的與免疫相關的慢性炎癥皮膚病，歐美人群的發病率約為2%[1-2]。銀屑病的病程長，復發率高，不僅影響美觀，還會引發多種并發癥，如銀屑病關節炎、克羅恩病、心血管疾病以及導致患者發病率和死亡率增加的抑郁癥等，極大危害患者的身心健康，降低患者的生活質量[3-4]。然而，銀屑病迄今尚無可治愈的藥物或治療方法。因此，尋找與銀屑病發生、疾病嚴重程度以及炎癥水平相關的生物標志物，對銀屑病患者病情的監測以及改善患者預后具有重要意義。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一類長度>200個核苷酸的不具有編碼蛋白質功能的RNA，參與調控多種生物學功能，如胚胎干細胞的分化、腫瘤的發生等生理或病理過程[5-8]。INK4位點的反義非編碼RNA(antisense noncoding RNA in the INK4 locus, ANRIL)是一條從染色體9p21.3轉錄而來的lncRNA，長為3.8 kb。研究發現，lncRNA ANRIL的水平與牙周炎、冠狀動脈疾病(coronary artery disease, CAD)和缺血性卒中的發病風險正相關[9-14]，說明lncRNA ANRIL與炎癥關系緊密，而銀屑病也是一種以高度炎癥為特征的皮膚疾病。因此，推測lncRNA ANRIL在銀屑病的發病和進展中也有著重要作用。本研究旨在評估lncRNA ANRIL在銀屑病患者病變皮膚組織中的表達水平及其與疾病嚴重程度和炎癥因子水平的關聯。

1 對象與方法

1.1對象 連續納入于2016年7月-2018年6月就診的銀屑病患者204例，男性122例，女性82例，年齡(46.4±12.4)歲(19～87歲)，體質量指數(body mass index, BMI)為(23.6±4.10)kg/m2(14.4～33.9 kg/m2)，中位病程、受累體表面積(body surface area, BSA)和銀屑病皮損面積及嚴重度指數(psoriasis area and severity index, PASI)分別為10.0年(5.0～14.8年)，19.0%(16.0%～22.0%)和8.4(6.8～12.1)。正在接受局部治療、光療、系統性非生物或生物制劑治療的患者分別有186，172，140和22例。納入標準：(1)確診為銀屑病；(2)年齡>18歲；(3)同意鉆取皮膚病變組織及附近非病變組織。排除標準：排除伴隨除銀屑病以外的皮膚炎癥疾病，或伴隨其他系統性免疫疾病，如類風濕關節炎、紅斑狼瘡等患者。本研究獲醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1收集數據及獲取樣本 記錄患者的年齡、性別、BMI、病程、銀屑病受累BSA，并評估PASI評分。記錄患者正在使用的藥物類型，排除藥物對lncRNA ANRIL水平的影響。鉆取3 mm深度的病變皮膚組織標本及病變5 cm外的配對正常皮膚組織標本，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.2定量聚合酶鏈反應(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)檢測 采用qPCR檢測病變皮膚組織及配對正常皮膚組織的lncRNA ANRIL表達量，并檢測病變皮膚組織標本的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8、IL-17和IL-22 mRNA表達量。具體操作如下：采用Trizol (美國Invitrogen公司)提取組織總RNA后，采用PrimeScript RT reagent (日本TaKaRa公司)進行RNA的逆轉錄，然后采用One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (日本TaKaRa公司)進行qPCR定量檢測。以磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase, GAPDH)作為內參，采用2-△△Ct法計算目標基因的相對表達量。lncRNA和GAPDH引物均根據NONCODE數據庫和National Center for Biotechnology Information (NCBI)數據庫的基因序列進行設計(表1)。

表1 qPCR引物序列

lncRNA：長鏈非編碼RNA；ANRIL：INK4位點的反義非編碼RNA；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細胞介素; GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶.

2 結 果

2.1lncRNA ANRIL表達水平在區分銀屑病病變皮膚組織和正常皮膚組織中的作用 qPCR檢測結果顯示，lncRNA ANRIL在病變皮膚組織[2.135(1.013～3.343)]中的表達量高于配對正常皮膚組織[1.131(0.506～1.833)](P<0.001, 圖1A)。lncRNA ANRIL表達水平區分銀屑病病變皮膚組織和正常皮膚組織的ROC曲線下面積(area under the curve, AUC)為0.711(95%CI：0.656～0.766)，取最佳切割點lncRNA ANRIL表達量1.966為閾值時(定義為ROC曲線上特異度+敏感度為最大值的點)，其區分銀屑病病變皮膚組織和正常皮膚組織的敏感度為54.9%，特異度為78.6%(圖1B)。

圖1 lncRNA ANRIL在銀屑病病變組織和正常皮膚組織中的表達差異Fig 1 The differential expressions of lncRNA ANRIL in psoriatic lesions and normal skin tissues

2.2lncRNA ANRIL表達水平與患者臨床特征的關聯 病變皮膚組織lncRNA ANRIL表達量與PASI評分正相關(r=0.261，P<0.001)，而與患者的年齡(r=0.080,P=0.257)、BMI(r=0.063,P=0.370)、病程(r=0.017,P=0.814)或受累BSA(r=0.118，P=0.092)無相關性(表2)。此外，病變皮膚組織的lncRNA ANRIL表達量與性別(P=0.118)、局部治療(P=0.913)、光療(P=0.252)、系統性非生物制劑治療(P=0.644)或系統性生物制劑治療(P=0.625)同樣無關(表3)。

表2病變皮膚組織lncRNA ANRIL相對表達量與患者臨床特征(連續變量)的關聯分析

Tab 2Association between lncRNA ANRIL relative expression in psoriatic lesions and clinical characteristics (continuous variable) of psoriatic patients

臨床特征(連續變量)相關系數rP值年齡0.0800.257BMI0.0630.370病程0.0170.814受累BSA0.1180.092PASI評分0.261<0.001

lncRNA：長鏈非編碼RNA；ANRIL：INK4位點的反義非編碼RNA；BMI：體質量指數；BSA：體表面積；PASI：銀屑病皮損面積及嚴重度指數.

表3病變皮膚組織lncRNA ANRIL相對表達量和患者臨床特征(分類變量)的關聯

Tab 3Association of lncRNA ANRIL relative expression in psoriatic lesions with clinical characteristics (classified variable) of psoriatic patients

臨床特征(分類變量)lncRNA ANRIL相對表達量性別 女2.304(1.112～3.705) 男1.958(0.954～3.202)局部治療 無2.019(0.940～3.295) 有2.165(1.022～3.366)光療 無2.500(1.213～3.983) 有2.117(0.985～3.269)系統性非生物制劑治療 無2.243(1.205～3.424) 有2.071(0.903～3.295)系統性生物制劑治療 無2.071(0.982～3.401) 有2.376(1.170～3.223)

lncRNA：長鏈非編碼RNA；ANRIL：INK4位點的反義非編碼RNA.

2.3影響PASI評分的因素分析 單元線性回歸分析提示，病變皮膚組織lncRNA ANRI表達水平(P=0.001)、年齡(P=0.014)、受累BSA(P<0.001)和局部治療(P=0.005)均與更高的PASI評分相關；多元線性回歸(逐步)分析顯示，病變皮膚組織lncRNA ANRIL高表達(P=0.013)、較大的受累BSA(P<0.001)和局部治療(P=0.008)與患者PASI評分更高獨立相關(表4)。

2.4病變皮膚組織lncRNA ANRIL表達量與炎癥因子水平的關聯 qPCR檢測顯示，病變皮膚組織中TNF-α，IL-6，IL-8，IL-17和IL-22 mRNA的表達量分別為2.223(1.417～2.985)，1.736(1.086～2.521)，2.529(1.504～3.750)，2.397(1.610～3.417)和2.782(1.642～4.220)。Spearman等級相關檢驗顯示，病變皮膚組織中，lncRNA ANRIL表達量與TNF-α(r=0.248,P<0.001)、IL-6(r=0.219,P=0.002)和IL-17(r=0.252,P<0.001)表達水平正相關，而與IL-8(r=0.065,P=0.355)和IL-22(r=0.097,P=0.069)表達水平無顯著相關性(表5)。

3 討 論

lncRNA ANRIL不僅是調節細胞增殖、分化、凋亡以及介導細胞耐藥的重要基因，還是調節炎癥反應的重要參與者[15-16]。研究報道，lncRNA ANRIL可通過激活半胱天冬酶結構域家族成員8(caspase recruitment domain family member 8, CARD8)來抑制核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)途徑，從而抑制缺血性腦卒中患者的炎癥反應[13,17]。另有研究發現，高表達的lncRNA ANRIL可通過與轉錄因子陰陽1(Yin-Yang 1, YY1)形成功能性復合物，從而促進NF-κB下游炎癥基因IL-6和IL-8的表達，進而促進CAD的炎癥反應[18]。這些研究提示，lncRNA ANRIL對炎癥的調控具有雙向性。此外，lncRNA ANRIL在腦卒中組織中高表達，且其高表達與CAD高發病風險相關[13,19-21]。研究也發現，頸動脈硬化斑塊lncRNA ANRIL的表達量與頸動脈粥樣硬化的嚴重程度正相關[21]。由此可見，lncRNA ANRIL的表達水平與一些炎性疾病的發生和疾病嚴重程度相關。鑒于銀屑病是一種以皮膚角質形成細胞過度增殖、分化和持續的皮膚炎癥為特點的慢性疾病，推測lncRNA ANRIL的表達水平與銀屑病的發生和進展相關。筆者評估了銀屑病患者病變皮膚組織和配對正常皮膚組織中lncRNA ANRIL的表達量，結果顯示，lncRNA ANRIL在銀屑病患者的病變皮膚組織中的表達量顯著高于正常皮膚組織，ROC曲線結果也顯示，lncRNA ANRIL表達量可以較好地區分銀屑病病變皮膚組織和正常皮膚組織。此外，關聯分析結果顯示，lncRNA ANRIL表達量與銀屑病的疾病嚴重程度正相關，進一步的多元線性回歸分析表明，病變皮膚組織lncRNA ANRIL高表達與患者更高疾病嚴重程度獨立相關。這些結果可能的原因是：(1)lncRNA ANRIL可能通過多種途徑參與銀屑病的炎癥，如通過調節NF-κB途徑增加促炎因子IL-6和IL-8的表達水平，從而促進銀屑病的炎癥反應，因此其在銀屑病的病變皮膚組織中高表達并與更高的疾病嚴重程度相關[18]。(2)lncRNA ANRIL在銀屑病中的作用可能與其在癌癥中的作用相似，可以通過促進角質細胞的增殖，抑制角質細胞凋亡，從而導致銀屑病角質細胞過度增殖，因此lncRNA ANRIL在銀屑病病變組織中高表達，患者表現更高的疾病嚴重程度[15]。(3)lncRNA ANRIL可能通過介導細胞耐藥的方式來促進銀屑病的進展[16]。此外，本研究還發現，受累BSA較大和接受局部治療同樣與患者更重的疾病嚴重程度獨立相關，可能是因為受累BSA是PASI評分中的一個標準，因此，受累BSA越大PASI評分越高；至于局部治療，可能是因為這種治療方式效果不明顯，疾病控制度差，因此PASI評分高。

表4 影響PASI評分的線性回歸分析

B：非標準化系數；Beta：標準化系數；PASI：銀屑病皮損面積及嚴重度指數；lncRNA：長鏈非編碼RNA；ANRIL：INK4位點的反義非編碼RNA；BMI：體質量指數；BSA：體表面積；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細胞介素.

表5病變皮膚組織lncRNA ANRIL相對表達量和炎癥因子mRNA相對表達量的關聯

Tab 5Association between lncRNA ANRIL relative expression of psoriatic lesions and relative expression of inflammatory cytokine mRNA

炎癥因子mRNA相對表達量相關系數rP值TNF-α0.248<0.001IL-60.2190.002IL-80.0650.355IL-170.252<0.001IL-220.0970.169

lncRNA：長鏈非編碼RNA；ANRIL：INK 4位點的反義非編碼RNA；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細胞介素.

為進一步確定lncRNA ANRIL與銀屑病炎癥的關系，本研究檢測了銀屑病患者病變皮膚組織中的幾個炎癥因子mRNA的表達水平，并與lncRNA ANRIL在病變皮膚組織中的表達量做了關聯分析，結果顯示，銀屑病病變皮膚組織中lncRNA ANRIL水平與TNF-α、IL-6和IL-17水平正相關，表明lncRNA ANRIL可能是通過促進患者的炎癥來加重患者的疾病嚴重程度。這可能與其在CAD中的促炎作用相同，lncRNA ANRIL通過調控多種通路，如誘導NF-κB途徑激活來促進NF-κB下游的促炎因子TNF-α，IL-6和IL-17的表達[18]。

此外，本研究還存在一些局限性：(1)本研究為單中心研究，可能存在選擇偏倚；(2)本研究樣本量較小，可能導致統計效能較低；(3)本研究未評估lncRNA ANRIL在銀屑病治療中的作用，這需要在將來研究中進一步探索。

綜上所述，lncRNA ANRIL表達水平在銀屑病病變皮膚組織中高表達，且與銀屑病患者疾病嚴重程度及炎癥因子水平正相關。