顯微切片掃描系統的應用與管理經驗探討

鄭 翔，畢文杰

顯微切片掃描系統的應用與管理經驗探討

鄭 翔1，畢文杰2

（1. 四川大學 華西基礎醫學與法醫學院 基礎醫學專業實驗室，四川 成都 610041；2. 成都醫學院 人體解剖學與組織胚胎學教研室，四川 成都 610500）

根據管理和應用顯微切片掃描系統的經驗，圍繞設備性能指標、應用場合、設備管理和標本制備技術等4個方面，闡述了當前存在的主要問題，并提出相應的改進措施。

顯微切片掃描系統；切片全景成像；設備管理；顯微制片

隨著遠程病理診斷和數字化圖像分析手段的日益進步，顯微切片的全景成像（whole slide imaging）和數字化建檔已逐漸普及。顯微切片掃描系統（microscopic slice scanning system）則在顯微拍攝的功能之外，實現了整張切片全部信息的掃描采集，使實驗與教學觀察、圖像數據分析和遠程會診的效率顯著提升[1-3]。此外，切片掃描成像還大幅降低了標本的維護成本，同時避免了因實驗樣本或臨床病例難以再次獲得而造成的標本短缺[4]。目前已有不少文章探討了數字化顯微切片的應用價值[5-8]、問題與挑戰[9-10]，以及掃描系統的工作模式[11-13]。我們在顯微切片掃描系統的應用和管理過程中感受到：雖然大家認識到該系統的功能價值并積極使用，但大多未全面認識掃描成像模式對顯微制片工作的要求，對一些配套技術的掌握尚有欠缺，所以顯微切片掃描系統的應用并未真正起到提質增效和節省材料的效果。顯微切片掃描系統雖然型號各異，但操作應用上有很多共通的知識和技巧。在本文中，根據近年應用顯微切片掃描系統的心得，探討該類系統的應用技術和管理經驗，爭取為其他單位的相關工作提供有益的參考。

1 顯微切片掃描系統的技術用途和關鍵性能參數

之所以將顯微切片用掃描的方式而不是傳統的拍照方式采圖，主要取其完整性。掃描獲得的全景數字化切片，可在用戶計算機上繼續閱片和處理圖像。不過，掃描采圖針對的是超過1個視野的較大范圍，耗時更長，某些情況下可能產生拼接痕跡，圖像占用的儲存空間也很大。因此，如果實驗目的是要快速檢片，且所需展示的結構不超過1個視野，就不必用掃描系統采圖。此時傳統的鏡下觀察、顯微拍照是最快的方法。另外，如果切片展示的方式和倍數確定，也沒有必要用掃描模式采圖，可在掃描系統的屏幕上將切片放大倍數調整好后直接拍照。

有必要掃描成像的場合是：（1）需要呈現大于1個視野的結構；（2）未來圖像的呈現倍數尚不確定；（3）有的分析和處理操作需要在不同的放大倍數下進行。有必要全片掃描的場合，則僅限于經典切片的數字化建檔和某些科研陣列切片的采圖。了解上述用途，有利于節省時間和磁盤空間。

尚未裝配掃描系統的單位，可根據自己的實際需求，選擇合理的型號。目前市售顯微切片掃描系統已有數十種，儀器外觀和價格迥異。從外觀上，掃描系統可大致分為顯微鏡式和箱式兩類。兩類結構的核心功能都以精確電動載物臺、電動物鏡和電腦軟件的拼接算法為基礎，并無實質性的功能差別。從我們使用的經驗看，箱式結構更優。因為一方面，掃描系統的操作幾乎均在計算機屏幕上進行，顯微鏡式結構的各個準焦螺旋、調節臂和鏡頭不用手工操作；另一方面，顯微鏡式結構留下很多接口和縫隙，易受灰塵和微生物的滋擾。箱式結構在降低操作損傷和防塵方面有優勢。箱式結構的缺點是不利于油鏡掃描操作，大多數公司的產品僅能支持40×物鏡的普通高倍掃描。Precipoint M8/O8等采用了鏡頭外露的半箱式結構，這類機型的掃描速度相對慢些，但在使用油鏡觀察和掃描的場合非常方便。

選配顯微切片掃描系統時，應重點關注物鏡型號、數碼成像設備參數、計算機處理速度和軟件易用性這4類信息。圖像拼接算法以獲得的顯微圖像為基礎，且與具體的設備型號有關，因此成像和拼接的質量主要由光學器件的性能決定。

物鏡仍然是最重要的部件，物鏡的性能決定了掃描成像能達到的最佳質量。物鏡上的銘文標識了該型號物鏡的放大倍數、鏡口率（或稱數值孔徑，numerical aperture）、焦深等參數。其中，鏡口率特別重要。以40倍物鏡為例，鏡口率為0.95的，成像清晰度高于僅有0.65的。光學鏡頭成像質量好，數碼CCD等電子部件的質量也應提高。

高信噪比的CCD[14]有利于獲得細膩、穩定的圖像。掃描和存儲速度則是一項決定操作效率的指標。在特定的掃描和圖像算法模式下，數字信號傳輸和處理的速度越快，完成掃描拼接和圖像再現的時間越短，軟件出錯的概率越低。因此，計算機的內存越快、磁盤讀寫速度越快，掃描系統的性能發揮就越有保障。

相對掃描系統主機，計算機性能提升所需增加的費用很少，性能降低對操作速度的影響明顯，故不可在計算機上過于節省。最后，掃描系統的軟件是否簡便易用，也對工作效率有影響。在功能相當的前提下，更加簡易和穩定的軟件環境有利于提高設備的使用率和減少操作故障；為此必須聯系供應商提供樣機試用，才能得出結論。上述4類參數決定了掃描系統工作的實際性能和用戶體驗。

2 切片采圖的操作類型和應用場合

不論哪種型號，顯微切片掃描系統均應具備單視野定焦拍照、單視野變焦拍照、可變倍率拍照、選區全景掃描4種操作類型。應根據標本種類和圖像，靈活選擇操作類型。表1列舉了各種操作的應用場合。其中，單視野定焦拍照與傳統的顯微拍照等同，它與選區全景掃描都是使用頻率最高的操作。

表1 顯微切片掃描系統采圖操作的基本類型和用途

選區全景掃描的不同模式在選擇時應特別注意。大多數場合使用定焦快速掃描或多點聚焦掃描即可滿足采圖需要。多點聚焦模式下，系統在選區內選擇數個位點對焦，計算出整個選區最合適的焦距，只要切片厚度均勻，采用系統計算的焦距掃描就能獲得最清晰的圖像。

如果薄切片的局部可能有凹凸不平的情況，或者局部厚度與周圍不一致，就需要采用實時聚焦掃描。此時每移動一次視野，系統都要重新聚焦，速度明顯減慢，但避免了局部成像模糊的問題。

軸融合掃描主要針對血管灌注染色、Golgi銀染神經組織、鋪片等厚片，理論上可將各個焦平面的圖像融合并全部清晰呈現出來；此時掃描成像的速度最慢。

3 設備使用和管理中遇到的主要問題

盡管操作者可通過說明書、實驗室網上規程和設備信息牌等途徑方便地獲知顯微切片掃描系統的使用方法，但實際操作時往往存在效率低、誤操作或得不到理想圖像等問題。產生這些問題的主要原因是實驗操作者對顯微形態學數據的呈現方式缺乏經驗，同時未準確理解掃描成像的原理和過程。下面幾項是我們在設備管理和培訓中總結的常見問題及改進方法，可顯著提高操作的效率和質量。

（1）顯微切片在采圖前應充分閱片，確保采圖部位準確、結構典型。實際工作中，絕大部分操作者在使用掃描系統前并未仔細閱片，上機后才臨時尋找適合拍照和掃描的區域。掃描系統雖然采圖靈活，但先須生成切片的預覽圖，且每次移動到新的視野要進行聚焦和掃描，耗時遠長于顯微鏡閱片。

從以下一項簡單的測試即可看出工作效率的顯著差異。取胰腺高血糖素免疫組織化學染色切片，斷面上僅顯示了1個胰島；請12位受過訓練的實習生，先后通過傳統顯微鏡觀察照相和掃描系統采圖的方法，獲得1張高倍的胰島圖像；實驗中顯微鏡和掃描系統均已完成開機自檢，比較從放上切片到獲得最終圖像的時間以及圖像的質量（主要為結構細節的清晰度、色彩、成像偽差等）。結果表明，傳統顯微鏡的采圖速度均快于掃描系統（圖1），圖像質量二者相當（本文未顯示該圖片）。

圖1 顯微切片掃描系統和傳統顯微照相在相同切片單視野拍照任務中的耗時比較（L、M為兩款不同類型、不同生產廠商的切片掃描系統，傳統顯微鏡的型號為OlympusBX41（數碼相機連接電腦軟件系統）; *與傳統顯微照相比較，P < 0.01）

掃描系統的時間主要耗費在生成切片預覽圖的環節。如果閱片、選區和采圖均在掃描系統上進行，不僅耗時過多，還增加儀器各個電動部件的工作負荷，造成額外損耗。因此建議：掃描成像之前，應先通過顯微鏡閱片，快速確定切片是否可用于采圖、哪些部位需要采圖（在切片背面用標記筆指示）、采圖后用于何種目的（涉及圖像或文件夾命名，避免現場臨時起名造成遺忘或混亂）。這樣可大大節省上機時間，同時縮短整個采圖流程的總時間，提高操作效率。

（2）目的性不強地進行全片掃描，忽視單視野拍照和可變倍率拍照的操作。掃描系統可生成全景切片圖像，是有別于傳統顯微拍照的一項功能。實際工作中，不少操作者過度使用這種功能，反而降低效率。操作者往往希望先掃描生成全切片圖像，然后回去在計算機上慢慢觀察。通常，掃描系統在40×物鏡的放大倍率和定焦掃描的模式下，每掃描15mm×15 mm的正方形區域，耗時為4~7 min（因機型而異）。全部采用全片掃描的方式采圖，算上換片和預處理，每小時最多采集6張切片。如果觀察目標僅為某個不超過單視野的結構，或在較低倍數下比較某種分布/定位的特點，單視野拍照和可變倍率拍照才是最優的操作類型。此時進行全片掃描，保留了大量無用的圖像信息，速度很慢，且還得再次閱片，相當于做了一次無用功。

（3）盲目使用高倍物鏡。理論上說，切片掃描系統只要安裝高倍鏡，就能勝任各種倍數的拍照和掃描采圖。實際上，在不需要高倍鏡成像的場合，盲目使用高倍鏡也會大幅降低工作效率。40×物鏡的視野小，不僅單視野拍照時尋找目標結構較困難，掃描速度也比20×或10×物鏡慢。因此，在不需要高倍影像的場合，更換倍率合理的物鏡可大幅節省操作時間。當采集厚切片圖像時，還能減少出現拼接痕跡的概率。

（4）掃描模式選擇不當。切片掃描成像的操作有2個基本要求：一是圖像清晰，二是速度盡可能快。根據我們觀察，大多數操作者傾向于選擇實時聚焦掃描的模式，理由通常是擔心多點聚焦和定焦掃描的圖像不夠清晰。其實，裱貼平整的薄切片（厚度8 μm以下），定焦掃描、多點聚焦掃描和實時聚焦掃描獲得的圖像，清晰度幾乎沒有區別。實時聚焦掃描需要耗費更長的時間，降低采圖速度，并且有增加拼接痕跡的風險。以150 μm厚Golgi-Cox染色的大腦皮質切片為例，40×物鏡的定焦掃描沒有任何圖像拼接的痕跡（圖2(a)），而實時聚焦掃描則可見到（圖2(b)）。相鄰視野如果聚焦結果差別較大，拼接的接縫處就難以完全調整對齊。為了提高厚片掃描的焦深，更換20×物鏡掃描效果更佳。如果要看清樹突棘，40×物鏡下進行單視野變焦拍照，效果優于掃描成像。

圖2 厚度150 μm的大鼠大腦皮質Golgi-Cox染色片局部的掃描圖像（白色“→”示圖像拼接痕跡；標尺=200 μm；圖像通過Precipoint M8系統采集）

（5）依賴系統自帶的軟件進行圖像處理。與傳統的顯微拍攝系統一樣，顯微切片掃描系統自帶的軟件，能方便地進行細胞計數、長度和面積測量等分析操作，提高了實驗分析的速度和準確性。同時，軟件一般還附帶圖像處理的功能。設置該功能可能是行業競爭的結果，因為不少操作者會對圖像進行技術處理，以求實現圖像優化。實際上，要獲得滿意的顯微圖像，主要靠良好的標本制備技術，其次是采圖設備的性能，而不是靠圖像處理。圖像處理（如對比度、銳化、亮度、色相、飽和度、色彩平衡等參數調整）往往損失數據細節，畫蛇添足。此外，掃描生成的圖像，在系統配套的計算機屏幕上呈現的顏色、亮度等，移植到別的計算機或打印設備上是否合適尚不清楚，所以不應急于進行處理。

（6）設備操作的培訓壓力較大，操作規程尚需改進。本單位顯微切片掃描系統的登記使用人中，約30%僅使用過1次，另有約40%僅使用過2次，其他人也有不少未達到熟練的程度，操作期間尋求技術支持的頻次較高。因此，設備的操作培訓工作有較大壓力。解決方法之一是通知有顯微采圖需求的人員，不定期集中開展技術培訓，把方法和原理講清楚，全程演示主要的操作。同時，把操作視頻、操作規程和設備說明書上傳至學校的課程資源中心共享，方便操作者預習和隨時查閱。在制定操作規程的工作中，發現單一規程不能解決不同實驗的需求。有必要在操作規程中增加分支選擇的節點，并相應增加針對不同采圖目的參考規程，避免首次操作的人員茫然無措。

4 在使用切片掃描系統的場合優化標本制備

不論成像設備如何改進，顯微切片標本的制備都是關鍵的基礎性工作。除了用好常規的顯微制片技術外，還應針對新的成像設備，改進標本制備的某些方面。我們根據日常實踐，認為下面幾項問題需要優化，以更好地適應掃描采圖的技術模式，提升試驗工作的效率和質量。

（1）組織標本的取材范圍應適當限制。不少實驗人員在取材、制片過程中，除了目標結構，還保留了很大范圍的無關組織。多余組織一方面增加化學試劑浸透的時間和難度，降低各類化學作用的均一性；另一方面還影響顯微觀察。傳統顯微拍照只顯示一個視野的圖像，而掃描成像則使無關組織一覽無余。系統自動聚焦時，容易受到大面積多余組織的干擾，有時目標結構的成像反而不清晰。取材范圍增大也造成圖像占據過多的存儲空間，增加數據管理維護的工作量。可見，科研工作中，要根據觀察目標適當局限標本的取材范圍，不要貪大求多，如此有利于提升實驗效率。

（2）掌握過硬的陣列切片技術。陣列切片法是將多個斷面以一定的次序裱貼在同一張載玻片上同時觀察的方法。陣列切片在科研實驗和臨床診斷中均有廣泛應用，具有實驗工作量少、組間對比準確可靠和便于高通量分析等優點[15]。但陣列切片技術對操作經驗要求較高，當前不少研究人員不太樂于進行這類精細而相對枯燥的操作。根據近幾年的觀察，實驗室的學生能做冷凍切片的就不做石蠟切片，能用單片（每張玻片1個標本）解決問題的就不做陣列片，技術操作雖然簡單一些，但效率低下。配備顯微切片掃描系統后，如果使用陣列片，一次即可采集多組圖像數據，還能在原來的基礎上再大幅縮減采圖和分析環節的工作量。因此，對于從事顯微形態學相關工作的人員，掌握過硬的陣列切片技術是十分必要的。使用陣列切片完成同一觀察任務，比使用單片快數倍到數十倍。

制作陣列切片的要領是包埋過程中保持組織硬度均一，切片操作保持穩定，以及切片裱貼方向一致。用于掃描采圖的陣列切片，還應注意兩點：一是盡可能排列緊密，二是各行/列平行排列。同時取材的相同種類的標本，在組織包埋時就組合在一起，即可達到上述要求。不同類型或不同取材批次的標本，可將組織周圍的包埋介質（如石蠟）盡量多切去一些，以便減少陣列片的間距；裱片操作時注意行列對齊，確保各行列平行排列（圖3）。達到上述要求，可節省大量用于掃描和處理空白背景圖像的時間，提高采圖速度。需要指出的是，有的掃描系統提供跳躍掃描模式（即自動偵測背景，跳過純背景區域，僅掃描有結構的區域），但我們在實踐中發現，如果切片裱貼不規律，這一模式容易發生局部遺漏，且在切片背景不太干凈時難以達到省時的目的。

圖3 陣列切片排布的優化（標本為HE染色的小鼠卵巢4 μm厚連續切片，40×物鏡以實時聚焦掃描模式完成框內結構采圖所需的時間）

（3）薄切片在明場顯微成像中更具優勢。自共聚焦顯微術普及以來，不少人認為切片厚度將不再是影響成像清晰度的重要因素。以熒光為基礎的各類高分辨力成像技術，記錄的是標本結構自身發出的光，切片厚度只要不阻礙光的穿透，不利影響確實已有辦法排除。但是，明場顯微成像記錄的是透射光，斷面越薄，圖像清晰度越高，厚切片的不利影響仍然難以克服。所以，不能認為現在對制片技術的要求降低了。要掃描獲取清晰的明場顯微圖像，薄切片具有明顯的優勢。除了圖像清晰度高，在薄切片上做組織化學反應，結果也更均一。此外，目前僅有石蠟切片法可確保獲得完整的連續切片，因此石蠟薄切片在三維重建、回顧性研究等場合具有獨特的優勢。所以不論配備的切片掃描系統是否具有熒光圖像處理功能，制備薄切片的技術仍十分重要。

（4）遵守切片美觀性的一般原則。傳統顯微切片制作過程中對切片美觀性的要求，在掃描成像的場合同樣適用。這些關系到美觀性的一般原則至少包括：結構完整、厚度薄而均勻、無褶皺和刀痕、核漿染色分明、背景及玻片清潔、裱貼位置和標簽信息正確等[16]。這不僅涉及切片的外觀，而且是對整套制片技術的規范。如果不遵守上述原則，難以通過掃描獲得高質量的圖像。比如，切片背景過深或玻片不潔凈時，掃描系統會將部分背景區域誤認為染色結構。結果圖像白平衡不良，自動聚焦易產生較大誤差，且使用跳躍掃描模式時難以節省時間。要改善該問題，必須在降低組織非特異性染色、減少染料沉淀和保持脫水、封片試劑潔凈等方面下功夫。又如，有的切片裱貼位置過于靠近載玻片邊緣，造成掃描系統無法采集到臨近邊緣的圖像。載玻片在掃描成像時需要固定在載片板或載物臺上，因此靠近載玻片邊緣的區域，特別是與磨砂邊相對的另一端，切片邊緣距載玻片邊界至少4 mm才保險；多數機型都用此區夾持或承載標本玻片，可能無法觀察到此區內的結構。

5 結語

顯微切片掃描系統為光學顯微成像提供了一種新的形式，使全景數字化切片建檔、顯微圖像分析、遠程閱片和三維重建等工作變得更加方便、快捷。在使用這一新設備的同時，還應充分了解其性能特點，要清楚認識到如何正確選用各種功能模式。同時，扎實掌握新的采圖模式下標本制備的關鍵技術。只有從應用管理和操作技術兩方面做好上述工作，才能真正發揮出掃描成像的技術優勢和高效率，適應實驗技術的發展和進步。

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Exploration on application and management experience of microscopic slice scanning system

ZHENG Xiang1, BI Wenjie2

(1. Laboratory of Basic Medicine, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610041, China; 2. Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China)

Based on the experience of management and application of micro-slice scanning system, this paper expounds upon the main problems existing at present from four aspects such as equipment performance index, application occasion, equipment management and specimen preparation technology and puts forward corresponding improvement measures.

microscopic slice scanning system; slice panoramic imaging; equipment management; microscopic slicing

R32-4

B

1002-4956(2019)11-0060-05

10.16791/j.cnki.sjg.2019.11.015

2019-03-17

四川省教育廳項目（17ZB0249）；四川大學教改八期項目（SCU8333）

鄭翔（1981––），男，四川成都，博士，高級實驗師，主要從事顯微技術和實驗室管理工作。E-mail: jasondf211@163.com

畢文杰（1982—），女，山東淄博，博士，講師，主要從事人體解剖與組織胚胎學工作。E-mail: bwj118@163.com